基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的作用機(jī)制＊

高 源，季 偉，肖 丹，劉 井，彭丹冰，彭 源

（1.貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)所 貴陽(yáng) 550004；2.武警貴州省總隊(duì)醫(yī)院 貴陽(yáng) 550005）

桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子；苦、甘，平；歸心、肝、大腸經(jīng)；具有活血祛瘀，潤(rùn)腸通便，止咳平喘之功效，主治經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，跌撲損傷，腸燥便秘等癥。紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花；辛，溫；歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功效，主治經(jīng)閉，痛經(jīng)，惡露不行，癥瘕痞塊，胸痹心痛，瘡瘍腫痛等癥[1]。紅花、桃仁兩者配伍使用是中醫(yī)活血化瘀經(jīng)典而常用藥對(duì)之一，始于《醫(yī)宗金鑒》桃紅四物湯，臨床療效顯著，后世延續(xù)至今。桃仁不僅能活血化瘀，而且還能推陳致新，適應(yīng)于多種血瘀證；紅花為“活血通經(jīng)止痛”之要藥；以紅花-桃仁藥對(duì)為基礎(chǔ)的著名藥方有補(bǔ)陽(yáng)還五湯、復(fù)元活血湯、血府逐癖湯、桃仁當(dāng)歸湯、紅花桃仁煎等[2,3]。目前，關(guān)于紅花、桃仁單味藥的化學(xué)成分、藥理研究及作用機(jī)制的報(bào)道較多[4-13]，但從細(xì)胞及分子水平進(jìn)行系統(tǒng)全面的揭示“紅花-桃仁”藥對(duì)以何種藥效成分通過(guò)何種途徑發(fā)揮防治冠心病的配伍機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。傳統(tǒng)中醫(yī)藥（理、法、方、藥）由于缺乏分子生物學(xué)的表征,無(wú)法發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，難以與現(xiàn)代科學(xué)有機(jī)的融合[14]；且“紅花-桃仁”藥對(duì)配伍使用化學(xué)成分更為復(fù)雜，給深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制帶來(lái)困難。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的理論及中藥“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的特點(diǎn)不謀而合，為中醫(yī)藥復(fù)雜系統(tǒng)的研究提供了新的視角和思路[15-19]。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)“紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分防治冠心病的作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行分析，以期揭示“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的配伍機(jī)制，為“紅花-桃仁”藥對(duì)的深入研究及開(kāi)發(fā)利用提供現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病作用機(jī)制的技術(shù)路線圖

1 方法

1.1 化學(xué)成分的建立

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索與“紅花-桃仁”藥對(duì)所含的全部化學(xué)成分，桃仁中共含有66 個(gè)化學(xué)成分，紅花中共含有189 個(gè)化學(xué)成分，因此，“紅花-桃仁”藥對(duì)中總共含有255個(gè)化學(xué)成分。

1.2 活性成分的篩選

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)（CNKI、PubMed）、TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，以ADME 參數(shù)（OB（E 以%和DLE 以d 文獻(xiàn)）及藥效活性為標(biāo)準(zhǔn)，篩選“紅花-桃仁”藥對(duì)的活性化學(xué)成分。

1.3 靶點(diǎn)的篩選與建立

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析，以Score cutoff 得分及P-value值等為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行“紅花-桃仁”藥對(duì)中活性成分作用靶點(diǎn)的篩選，建立靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。再依據(jù)相似性比較，將篩選出的活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過(guò)中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)（HIT，http://lifecenter.sgst.cn/hit/）和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）進(jìn)行活性成分潛在靶點(diǎn)的篩選，建立“紅花-桃仁”藥對(duì)潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，并通過(guò)人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，http://www.omim.org/）篩選“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的基因和蛋白靶點(diǎn)，建立冠心病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。人類的靶點(diǎn)連接蛋白通過(guò)交互蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://dip.doe-mbi.ucla.edu）獲得。最后將篩選得到的所有靶點(diǎn)均經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

通過(guò)PPI（http://www.genome.jp/kegg/）分析，將“紅花-桃仁”藥對(duì)的活性成分、成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、冠心病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和交互蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)連接成“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.6.1 軟件將以上網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，得到每個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality 三個(gè)拓?fù)鋮?shù)通過(guò)CentiScaPe 1.2 進(jìn)行評(píng)估，選擇以上3 個(gè)拓?fù)鋮?shù)值滿足分別大于所有點(diǎn)中位數(shù)值的靶點(diǎn)，作為“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的目標(biāo)靶點(diǎn)。

1.5 生物過(guò)程分析

將篩選出的目標(biāo)靶點(diǎn)使用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 通路分析和GO（Gene Ontology）生物學(xué)過(guò)程分析。然后再利用STRING（https://string-db.org/）對(duì)所篩選出的目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作關(guān)系分析。

1.6 構(gòu)建“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的通路圖

利用KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG Mapper 功能將活性成分作用的潛在靶點(diǎn)，在與冠心病最為密切的信號(hào)通路上標(biāo)注出來(lái)，驗(yàn)證中醫(yī)藥配伍機(jī)制是通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同發(fā)揮治療作用。

2 結(jié)果

2.1 活性組分的篩選

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)，共查找得到“紅花-桃仁”藥對(duì)255 個(gè)化學(xué)成分，以ADME 參數(shù)（OB（E分%和DLE 分，以得）及藥效活性為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選得到38個(gè)活性化合物，其中與紅花相關(guān)的化學(xué)成分有21個(gè)，與桃仁相關(guān)的化學(xué)成分有17個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析，以Score cutoff得分及P-value值等為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到“紅花-桃仁”藥對(duì)活性化合物各自對(duì)應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建出“紅花-桃仁”藥防治冠心病作用的交互網(wǎng)絡(luò)，采用不同顏色和形狀圖形使其可視化后，可直觀的看出化學(xué)成分與疾病靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，黃色方形代表藥物與疾病共同作用的靶點(diǎn)，也是“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病作用最重要的靶點(diǎn)蛋白；黃色圓點(diǎn)代表冠心病直接作用靶點(diǎn)；紅色三角形代表“紅花-桃仁”藥對(duì)中篩選出的活性化合物；藍(lán)色圓點(diǎn)代表活性化合物的直接作用靶點(diǎn)；紫色圓點(diǎn)代表連接活性化合物與疾病靶點(diǎn)的交互蛋白。

2.3 “紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的直接作用靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析

通過(guò)Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行交互網(wǎng)絡(luò)分析，得到“紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分相關(guān)聯(lián)的蛋白靶點(diǎn)，并對(duì)這些靶標(biāo)蛋白進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)計(jì)算。以網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn) 的（Degree、Betweenness centrality 和 Closeness centrality）中位數(shù)均值作為計(jì)算結(jié)果，得到三個(gè)拓?fù)鋮?shù)分別為：4.0、0.002 1 和0.275 9。將三個(gè)拓?fù)鋮?shù)值均大于中位數(shù)均值的靶點(diǎn)作為紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的潛在靶點(diǎn)蛋白，共得到10個(gè)靶點(diǎn)滿足以上條件，結(jié)果見(jiàn)表2。將潛在靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行蛋白相互關(guān)系分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。蛋白相互關(guān)系分析說(shuō)明“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的潛在靶點(diǎn)蛋白相互關(guān)聯(lián)和彼此調(diào)節(jié)。

2.4 GO生物學(xué)功能分析

將10 個(gè)潛在靶點(diǎn)映射到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行GO 生物學(xué)功能富集分析，共富集得到66條生物過(guò)程，其中P 值≤≤物過(guò)程的生物過(guò)程共有22 條，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病與多條生物過(guò)程的調(diào)控相關(guān)，其中最為密切的生物過(guò)程包括脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、蛋白磷酸化的正調(diào)控、蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控等。反映了“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的配伍機(jī)制涉及體內(nèi)多個(gè)生物過(guò)程的異常，同時(shí)也表明了“紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這些生物過(guò)程發(fā)揮防治冠心病的作用。

表1 結(jié)紅花-桃仁”藥對(duì)活性化合物及靶標(biāo)數(shù)

圖2 中紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

表2 對(duì)紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分防治冠心病的直接作用靶點(diǎn)相關(guān)拓?fù)鋮?shù)

圖3 “紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的潛在靶點(diǎn)蛋白相互關(guān)系圖

2.5 KEGG 通路分析

將10 個(gè)潛在靶點(diǎn)映射到DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共富集得到18 條信號(hào)通路，結(jié)果見(jiàn)表4。其中7 條通路（P 通路）與“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的作用密切相關(guān)，包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、瘧疾、非洲錐蟲(chóng)病、NOD 樣受體信號(hào)通路等。圖4 為“紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分潛在靶點(diǎn)在腫瘤壞死因子關(guān)鍵信號(hào)通路上的標(biāo)注圖。

3 討論

表3 活紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病作用的GO生物學(xué)功能富集分析結(jié)果

表4 活紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病作用的KEGG通路富集分析結(jié)果

圖4 紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分潛在靶點(diǎn)在關(guān)鍵信號(hào)通路上的標(biāo)注圖

傳統(tǒng)中醫(yī)藥防治疾病的精髓是通過(guò)相互配伍，發(fā)揮“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)調(diào)作用的特點(diǎn)，但是配伍后化學(xué)成分的種類繁多復(fù)雜，難以闡明藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用靶點(diǎn)，給中醫(yī)藥配伍機(jī)制的研究帶來(lái)了難題?！凹t花-桃仁”藥對(duì)是中醫(yī)配伍中常見(jiàn)的活血化瘀藥對(duì)，兩者通過(guò)中藥“七情”中的相須相互協(xié)同增效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)挖掘大量數(shù)據(jù)，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)圖，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究提供了新的思路和方法，進(jìn)一步推動(dòng)了中醫(yī)藥的快速發(fā)展。目前，有關(guān)紅花、桃仁單味藥作用機(jī)制的研究比較集中，秦秀德等[20]MCAO 大鼠模型發(fā)現(xiàn)紅花注射液對(duì)急性腦梗死腦組織具有保護(hù)作用，相關(guān)機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)GRP78 表達(dá)和下調(diào)CHOP 介導(dǎo)CRP途徑發(fā)揮作用。劉楠等[21]通過(guò)MDA-MB-435 細(xì)胞證實(shí)紅花多糖能夠顯著降低PI3K、Akt、mTOR mRNA 和蛋白表達(dá)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)阻斷PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。李小波等[22]采用單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型，發(fā)現(xiàn)桃仁、紅花及其藥對(duì)可通過(guò)升高腎組織E-cadherin 和降低腎組織ILK、FN 及ααK腎組的表達(dá)來(lái)減緩腎間質(zhì)纖維化，結(jié)果表明桃仁-紅花藥對(duì)的效果最好。以敏等[23]采用寒凝血瘀證和瘀熱互結(jié)證的大鼠模型，研究桃仁改善血管內(nèi)皮功能的差異及可能的機(jī)制，結(jié)果顯示桃仁可同時(shí)改善寒熱不同血瘀證體征，降低兩證血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；桃仁對(duì)寒凝血瘀證和瘀熱互結(jié)證，可能的機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)NF-證，通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到了“紅花-桃仁”藥對(duì)38 個(gè)活性化合物，篩選出了718 個(gè)活性化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并以活性化合物和靶點(diǎn)構(gòu)建了“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，篩選出10 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，提示這些潛在靶點(diǎn)蛋白可能直接或間接參與防治冠心病的作用。通過(guò)GO 富集和KEGG 通路注釋分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)18 條信號(hào)通路及66 個(gè)生物過(guò)程參與“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病的作用，其中與防治冠心病相關(guān)的信號(hào)通路包括腫瘤壞死因子信號(hào)通路、瘧疾、非洲錐蟲(chóng)病、NOD 樣受體信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路主要涉及的生物過(guò)程包括脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、蛋白磷酸化的正調(diào)控、蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控等。由此推斷，“紅花-桃仁”藥對(duì)防治冠心病可能與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘和篩選，“紅花-桃仁”藥對(duì)活性成分，并對(duì)其作用靶點(diǎn)與機(jī)制進(jìn)行初步的篩選與分析，以期為“紅花-桃仁”藥對(duì)的藥效實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)，也為藥對(duì)中醫(yī)配伍機(jī)制的深入研究及開(kāi)發(fā)利用提供了現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。