血清miR-181b、miR-210 表達(dá)與妊娠期高血壓疾病患者炎性因子的關(guān)系

任 娜 季景環(huán)

河北省滄州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北滄州 061000

妊娠期高血壓疾?。℉DP）是妊娠期婦女的常見疾病，在我國發(fā)病率為5%～10%，以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕卣?，是僅次于產(chǎn)后出血導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的原因［1］。HDP 發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，早期診斷并評估病情的嚴(yán)重程度，是臨床制訂有效干預(yù)方案，減少HDP病情進(jìn)展的重要手段。微小RNA（miR）是一類高度保守的非編碼小分子RNA，長度為21～23 個(gè)核苷酸，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、生長、分化、凋亡、免疫應(yīng)答、惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程［2］。miR-181b、miR-210是常見的miR 分子，主要參與缺血性腦卒中等疾病的發(fā)病過程［3］，但其在HDP 發(fā)病過程中的作用相關(guān)報(bào)道較少。研究［4］發(fā)現(xiàn)，HDP 發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥細(xì)胞合成、炎性因子分泌貫穿整個(gè)環(huán)節(jié)。本研究通過檢測血清miR-181b、miR-210 水平，旨在探討其與HDP 患者的表達(dá)水平及與炎性因子的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016 年1 月～2018 年1 月河北省滄州市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治183 例HDP 單胎孕婦為病例組，同期選取55 名健康孕婦為對照組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。根據(jù)HDP 診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)［5］將病例組分為3 個(gè)亞組，妊娠期高血壓亞組51 例，輕度子癇前期亞組79 例，重度子癇前期亞組53 例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情且簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《婦產(chǎn)科學(xué)》（第7 版）［5］中關(guān)于HDP 的診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)；②單胎妊娠孕婦；③規(guī)律產(chǎn)檢，臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③雙胎及以上者；④合并妊娠期糖尿病者；⑤急慢性炎性反應(yīng)疾病者；⑥自身免疫性疾病者；⑦母體或胎兒為艾滋病或病毒陽性者；⑧胎兒先天性畸形的孕婦；⑨合并其他可能影響本研究結(jié)果的疾病。

表1 兩組基線資料比較（±s）

表1 兩組基線資料比較（±s）

1.2 方法

1.2.1 血清miR-181b、miR-210 相對表達(dá)量檢測

1.2.1.1 主要試劑和儀器 RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen公司，生產(chǎn)批號：20151126），美國Invitrogen 公司提供的PrimeScript? RT reagent Kit（生產(chǎn)批號：20150923）和QuantiFast? SYBR? Green Pcr Kit（生產(chǎn)批號：20151107），引物（上海捷瑞生物工程有限公司），5415R 型小型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），C1000 型Bio-Rad PCR 儀（美國BIORAD 公司），UV1900PC 型紫外分光光度計(jì)（常州三豐儀器科技有限公司）。

1.2.1.2 血清miR-181b、miR-210 檢測 提取RNA：抽取兩組肘靜脈血5 mL，常溫下靜置30 min 后，3000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，取血清置于-80℃環(huán)境下保存。血清中加入1 mL Trizol RNA，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA 總純度，比值在1.8～2.0，說明樣本合格。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-181b 正向引物序列：5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3′，反向引物序列：5′-GCGAAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′，長度為78 bp；miR-210正向引物序列：5′-CAATAACTGTGCGTGTGACAGC-3′，反應(yīng)引物序列：5′-TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3′，長度為77 bp；內(nèi)參基因U6 正向引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，長度為70 bp。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為20 μL，包括內(nèi)參基因U6 3 μL 和miR 特異性莖環(huán)引物，模板RNA 5 μL，100 mmol/L 的dNTPs 0.15 μL，50 U/μL 的反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，20 U/μL的RNase 抑制劑0.19 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5 μL，無菌不含酶的蒸餾水4.16 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，10 min；將提取的cDNA 在4℃的冰箱中保存。qRT-PCR 法：以cDNA 為模板，建立20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系，包括2×定量PCRMasterMix10μL，引物及探針Mix 1 μL，cDNA 模板1.33 μL，無核酸酶的蒸餾水7.67 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性12 s，60℃復(fù)性40 s，72℃延伸20 s，持續(xù)40 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次后取平均值，計(jì)算miR-181b、miR-210 相對表達(dá)量，以2-△△Ct表示，△Ct=Ct（miR-181b/miR-210）-Ct（U6）。

1.2.2 血清炎性因子水平檢測

酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10、IL-17 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α），操作過程嚴(yán)格按照試劑盒（上海科新生物技術(shù)股份有限公司，批號：20151023、20150609）說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 積矩相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較

病例組血清miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平均高于對照組，IL-10 水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

2.2 不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較

不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水（均P＜0.05）；輕度子癇前期亞組miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 高于妊娠期高血壓亞組，IL-10 低于妊娠期高血壓亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；重度子癇前期亞組miR-181b、miR-210 及IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 高于輕度子癇前期亞組，IL-10 低于輕度子癇前期亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表2 兩組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較（±s）

表2 兩組血清miR-181b、miR-210 及炎性因子水平比較（±s）

注：miR-181b：微小RNA-181b；miR-210：miR-210；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-10：白細(xì)胞介素-10；IL-17：白細(xì)胞介素-17；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

表3 不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 以及炎性因子水平比較（±s）

表3 不同HDP 亞組血清miR-181b、miR-210 以及炎性因子水平比較（±s）

注：與妊娠期高血壓亞組比較，*P＜0.05；與輕度子癇前期亞組比較，#P＜0.05。miR-181b：微小RNA-181b；miR-210：微小RNA-210；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-6：白細(xì)胞介素-6；IL-10：白細(xì)胞介素-10；IL-17：白細(xì)胞介素-17；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；HDP：妊娠期高血壓疾病

2.3 Pearson 積矩相關(guān)分析

HDP 患者血清miR-181b 與IL-1β（r=0.722，P＜0.01）、IL-6（r=0.759，P＜0.01）、IL-17（r=0.713，P＜0.01）、TNF-α（r=0.736，P＜0.01）呈正相關(guān)，與IL-10（r=-0.781，P＜0.01）呈負(fù)相關(guān)。HDP 患者血清miR-210 與IL-1β（r=0.765，P＜0.01）、IL-6（r=0.793，P＜0.01）、IL-17（r=0.738，P＜0.01）、TNF-α（r=0.772，P＜0.01）呈正相關(guān)，與IL-10（r=-0.745，P＜0.01）呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

HDP 是僅在妊娠期發(fā)生的嚴(yán)重并發(fā)癥，多數(shù)患者病情較輕，少數(shù)嚴(yán)重患者可出現(xiàn)抽搐、昏迷、心力衰竭、腎功能不全以及胎盤早剝等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可致死亡［6］。HDP 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是遺傳因素、免疫失衡、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、滋養(yǎng)細(xì)胞缺血等多種因素共同作用的結(jié)果［7］。miR 是在真核生物中廣泛存在且在組織中的表達(dá)具有特異性的內(nèi)源性非編碼RNA，可發(fā)揮抑制目標(biāo)miR 分子翻譯活性的功能［8］。研究［9］顯示miR 介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫應(yīng)答過程，同時(shí)參與激素的分泌及神經(jīng)發(fā)育、惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展等病理生理過程。

miR-181b 參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、免疫性疾病以及惡性腫瘤的發(fā)病。Zhang 等［10］發(fā)現(xiàn)，miR-181b 在癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠模型海馬組織中呈低水平表達(dá)，并且通過Notch 信號通路，對抗凋亡基因Nrarp 起到負(fù)調(diào)控作用。蘇顯都等［11］發(fā)現(xiàn)，miR-181b表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)精神分裂癥發(fā)病過程，可作為評估精神分裂癥患者病情改善、治療效果及預(yù)測預(yù)后的潛在靶向指標(biāo)。Sun 等［12］通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠炎性反應(yīng)過程及血管內(nèi)皮損傷時(shí)血清miR-181b 表達(dá)異常，由此推斷其參與動脈粥樣硬化過程。姚育紅等［13］證實(shí)，miR-181b 作為促癌基因在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-210 基因位于人體11 號染色體上，屬于缺氧激活因子，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)，組織miR-210 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)新生血管的形成［14］。Ma 等［15］在構(gòu)建缺血缺氧性腦損傷大鼠模型中增加miR-210 模擬物，大鼠腦水腫明顯加重，而抑制miR-210 表達(dá)則可減少腦損傷，miR-210 在新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要功能。齊京鵬等［16］發(fā)現(xiàn)，miR-210 通過調(diào)控靶基因介導(dǎo)胃癌的發(fā)病過程，有望成為診斷胃癌的靶向指標(biāo)。陸蕓瑤等［17］證實(shí)，乳腺癌患者惡性腫瘤細(xì)胞不斷增殖形成缺氧環(huán)境，激活組織中miR-210 的表達(dá)。另有研究［18］顯示，miR-210 參與缺血性腦卒中后的炎性反應(yīng)過程，還與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，miR-181b、miR-210 在HDP 患者中表達(dá)上調(diào)，隨著HDP 病情嚴(yán)重程度的增加，其表達(dá)水平上調(diào)明顯，提示miR-181b、miR-210 參與了HDP 發(fā)病過程。此外，病例組血清促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 水平顯著高于對照組，抑炎因子IL-10 低于對照組，并且病情越重，促炎因子水平越高，抑炎因子水平越低，與馬彩蓮等［19］研究結(jié)果相似。HDP 發(fā)病時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體釋放大量促炎因子，激活炎性反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管通透性增加，臟器缺氧缺血；IL-10 作為抑炎因子，可使機(jī)體的免疫反應(yīng)降低，使促炎因子合成并分泌。多種炎性因子通過級聯(lián)反應(yīng)破壞胎盤細(xì)胞因子間的動態(tài)平衡，進(jìn)而參與HDP 整個(gè)發(fā)病過程。因此，早期檢測炎性因子有助于臨床評估HDP 病情嚴(yán)重程度。

Pearson 積矩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，HDP 患者血清miR-181b、miR-210 與IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α 呈正相關(guān)性，與IL-10 呈負(fù)相關(guān)性，提示miR-181b、miR-210可能通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)過程而參與HDP 發(fā)病過程。miR-181b 在內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB 信號通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)促炎因子的合成和釋放，加重血管炎性反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終參與HDP 發(fā)?。?0］。miR-210 作為缺氧激活因子，通過相應(yīng)靶位可激活相應(yīng)信號通路，促進(jìn)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)紊亂，誘發(fā)促炎因子大量釋放，抑制抑炎因子釋放，最終參與HDP 發(fā)病過程［21］。

綜上所述，miR-181b、miR-210 通過介導(dǎo)炎性因子的釋放而參與HDP 發(fā)病過程，并且與病情嚴(yán)重性密切相關(guān)。