一株罕見(jiàn)Ihumii放線(xiàn)菌的分離和鑒定

張維清，林宇嵐，甘龍杰，陳守濤，張文明，楊 濱△

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.骨科，福建福州 350005)

放線(xiàn)菌大多存在于健康人口腔、上呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等與外界相通的腔道，是寄居人體的一種正常菌群[1-2]。當(dāng)機(jī)體免疫力減弱、口腔衛(wèi)生不良、拔牙或外傷時(shí)，可侵入組織導(dǎo)致皮膚、皮下組織，肌肉，骨骼及中樞神經(jīng)系統(tǒng)化膿性感染[3]。根據(jù)感染的途徑和涉及的器官不同，臨床上分為面頸部、胸部、腹部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。其主要特征為慢性化膿性肉芽腫病變，以向周?chē)M織擴(kuò)展形成瘺管并排出帶有硫磺樣顆粒的膿液為特征。絕大多數(shù)放線(xiàn)菌易引起內(nèi)源性感染，大量應(yīng)用免疫抑制劑是一個(gè)重要的誘發(fā)因素。2015年，法國(guó)科學(xué)家從一個(gè)50歲的HIV感染者糞便中首次分離出一株新的放線(xiàn)菌，并命名為Ihumii放線(xiàn)菌[4]。福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院于2016年收治一例由Ihumii放線(xiàn)菌引起的膝關(guān)節(jié)化膿性感染，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男，72歲，既往患有高血壓和甲狀腺功能亢進(jìn)。就診本院前2月因外傷致“左膝髕骨粉碎性骨折”，于院外行“左髕骨骨折切口復(fù)位內(nèi)固定術(shù)”，術(shù)后切口愈合不良。術(shù)后1個(gè)月，因“左膝切口裂開(kāi)”再次求診，該院行“左膝部二期清創(chuàng)術(shù)”，術(shù)后10 d切口流出黃膿液、發(fā)惡臭、伴發(fā)熱。遂于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院多次行清創(chuàng)術(shù)，治療上予抗感染、補(bǔ)液及對(duì)癥治療(具體不詳)，今為求進(jìn)一步診治，患者就診福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，門(mén)診擬“左膝關(guān)節(jié)感染”收入住院(圖1A)。實(shí)驗(yàn)室檢查,白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC):17.9×109/L,血紅蛋白(Hb):112 g/L,血小板計(jì)數(shù)(PLT):230×109/L,C反應(yīng)蛋白(CRP):59.5 mg/L,PCT:0.38 ng/mL。

1.2儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)、甲酸、α-氰基-4-羥基苯丙酸(HCCA)均由德國(guó)Bruker公司及Sigma公司提供；ABI 2700普通PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng))；快速革蘭染色液(Baso)；細(xì)菌16S rRNA 基因擴(kuò)增通用引物：27f:AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 和1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT由上海生工合成，PCR反應(yīng)體系采用美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。

1.3細(xì)菌培養(yǎng)及形態(tài)觀察 膿液分泌物標(biāo)本分區(qū)劃線(xiàn)接種于2塊哥倫比亞血平板、一塊沙保羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、一塊選擇巧克力平板。一塊血平板與選擇巧克力平板置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，35 ℃恒溫孵育，每天觀察血平板的生長(zhǎng)情況；另一塊血平板行厭氧培養(yǎng)，35 ℃恒溫孵育，每天觀察平板的生長(zhǎng)情況。沙保羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)置于25 ℃恒溫孵育，亦每天觀察其生長(zhǎng)狀況。術(shù)后壞死組織經(jīng)研磨后，亦行上述同條件培養(yǎng)。根據(jù)第四版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，陽(yáng)性培養(yǎng)進(jìn)行革蘭染色，油鏡觀察菌體形態(tài)。

1.4細(xì)菌MALDI-TOF-MS鑒定 用牙簽挑取單個(gè)待檢菌落，均勻涂抹于加樣金屬靶板小圈內(nèi)，同時(shí)在另一小圈內(nèi)亦均勻涂抹ATCC25922大腸埃希菌質(zhì)控菌株，待樣本室溫干燥后，加入1 uL的甲酸(70%)，室溫干燥后，加入1 μL的HCCA，待室溫干燥后上機(jī)檢測(cè)。

1.516S rRNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 采用煮沸法提取細(xì)菌的基因組核酸。細(xì)菌16S rRNA的PCR擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[5]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳，確認(rèn)存在目的條帶，產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。測(cè)序的序列用Vector NTI 8.0軟件包中的Contig Express組件拼接。獲得的16S rRNA序列在GeneBank中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)初步確定其分類(lèi)位置。用Bioedit(vision3.3)合并樣本序列(序列名2016R)和參考序列為一個(gè)隊(duì)列，用MEGA5.1軟件以Kimura雙參數(shù)方法構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1病原菌培養(yǎng)結(jié)果 膿液和術(shù)后壞死組織經(jīng)分離培養(yǎng)后，均得到一株革蘭陽(yáng)性短桿菌。其生長(zhǎng)速度較緩慢，初次培養(yǎng)48 h后可形成直徑大約1～2 mm、灰白色、圓形、光滑、突起、邊緣整齊、無(wú)β溶血性菌落(見(jiàn)圖1B)，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[4]。在沙保羅葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和選擇巧克力平板均不能生長(zhǎng)。

注：A為患者入院時(shí)左膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷伴化膿性感染；B為5%CO2培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)48 h后血平板菌落形態(tài)

2.2細(xì)菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果 目標(biāo)菌通過(guò)MALDI-TOF-MS檢測(cè)及BioType軟件分析，獲得的目標(biāo)菌肽指紋圖譜如圖2示。鑒定結(jié)果報(bào)告顯示為瑞丁放線(xiàn)菌，但可信度為1.902。根據(jù)MALDI-TOF-MS報(bào)告對(duì)結(jié)果的解讀[6]，當(dāng)可信度值為1.700～1.999時(shí)，可鑒定放線(xiàn)菌屬，不能確定為放線(xiàn)菌某種，需進(jìn)一步鑒定。

圖2 Ihumii放線(xiàn)菌MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果圖

圖3 2016R放線(xiàn)菌部分16S rRNA基因與Ihumii放線(xiàn)菌及其他放線(xiàn)菌系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.316S rRNA基因序列鑒定及進(jìn)化樹(shù)分析 擴(kuò)增得到16S rRNA基因的反向序列，大小約870 bp，正向多次測(cè)序均失敗，存在較多雜峰、背景信號(hào)干擾，所以未納入本次分析中。反向的一半16S rRNA序列經(jīng)編輯，提交NCBI的Blast顯示，其與Ihumii放線(xiàn)菌(核酸登錄號(hào)為L(zhǎng)N866997和NR144728.2)相似率為100%。為了能夠更直觀反映該菌來(lái)源，本課題組利用MEGA5.1軟件Neighbor-joining tree法，構(gòu)建16S rRNA進(jìn)化樹(shù)。如圖3所示，可以明顯看出，本次發(fā)現(xiàn)的2016R放線(xiàn)菌株與2株2015年由法國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的Ihumii放線(xiàn)菌明顯在一簇上，Bootstrap值為72%。而且，他們共同與其他參考放線(xiàn)菌成一簇，Bootstrap值為99%。

3 討 論

放線(xiàn)菌病是一種少見(jiàn)的因感染放線(xiàn)菌所致的慢性感染性疾病，人獸共患，可產(chǎn)生局部化膿或肉芽腫性疾病，以多發(fā)膿腫和竇道瘺管為特征。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，放線(xiàn)菌病存在明顯的區(qū)域和性別差異，農(nóng)村明顯高于城市，男性多于女性，城市發(fā)病率僅為農(nóng)村的1/10，男女比例約為3∶1[7]。目前放線(xiàn)菌屬內(nèi)有47個(gè)種，由于其生在緩慢、培養(yǎng)條件苛刻，在行常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，容易被遺漏[8]。同時(shí)，又由于國(guó)內(nèi)對(duì)放線(xiàn)菌感染臨床特點(diǎn)、診斷、鑒別診斷等研究仍較少，而且，該菌屬所致疾病常呈隱匿性，缺乏較為典型的臨床表現(xiàn)，容易造成臨床醫(yī)生的診斷與治療困難，產(chǎn)生誤診或漏診。MALDI-TOF-MS是最近發(fā)展起來(lái)的一種可以快速鑒定細(xì)菌的新技術(shù)，依據(jù)不同菌種形成特異性的質(zhì)譜指紋圖譜對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，該技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確鑒定臨床常見(jiàn)菌[9]，但對(duì)少見(jiàn)、罕見(jiàn)菌鑒定時(shí)，由于其菌譜庫(kù)中種類(lèi)數(shù)量有限，其在鑒定方面仍存在著缺陷[6]。據(jù)LYNCH等[10]報(bào)道，MALDI-TOF-MS在鑒定放線(xiàn)菌方面，僅41%的放線(xiàn)菌能準(zhǔn)確鑒定到種，9%鑒定到屬，存在50%無(wú)法準(zhǔn)確鑒定。本文開(kāi)始采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，并以鑒定為瑞丁放線(xiàn)菌種，但鑒定值為1.902，所以可以確定2016R為放線(xiàn)菌屬某種，但無(wú)法確定其準(zhǔn)確種。

利用16S rRNA序列同源性分析對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定的技術(shù)已經(jīng)比較成熟。隨著GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，應(yīng)用該技術(shù)可以對(duì)病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的分類(lèi)鑒定。目前，應(yīng)用16S rRNA鑒定細(xì)菌菌屬時(shí)，當(dāng)目標(biāo)菌與GeneBank中比對(duì)序列相似度大于99%，可以鑒定為種；相似度為97%～99%，鑒定為屬；相似度低于97%，無(wú)法鑒定，可能為某種新的細(xì)菌[11]。因此，本研究又采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)一步復(fù)核鑒定，最終與Ihumii放線(xiàn)菌相似度為100%；同時(shí)如圖3所示，2016R菌株與Ihumii放線(xiàn)菌成一簇，由此可以鑒定本研究新發(fā)現(xiàn)的菌株為Ihumii放線(xiàn)菌。本研究相對(duì)不足之處是未得到16S rRNA約1 500 bp長(zhǎng)度的序列，盡管如此，但根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道，序列在300～900 bp之間就可以適用于多數(shù)廣譜PCR的診斷[12]。所以本研究中870 bp長(zhǎng)度的序列在通過(guò)GeneBank中比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析后是可以確定該菌就是Ihumii放線(xiàn)菌的。

對(duì)于膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷放線(xiàn)菌感染，由于病例較少，目前尚無(wú)統(tǒng)一的治療方案。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，目前多首選β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物進(jìn)行治療，在臨床治療過(guò)程中也根據(jù)藥敏結(jié)果使用一種或多種抗菌藥物聯(lián)合治療，療程約為6到12個(gè)月，早期診斷及有效抗菌藥治療的治愈率可達(dá)90%[14]。但也有專(zhuān)家指出，在治療中應(yīng)按照患者具體病情情況、感染部位的不同，選擇手術(shù)或非手術(shù)治療[15]。本病例中患者創(chuàng)傷明顯、組織壞死、膿液外流，通過(guò)手術(shù)，不但可以清除壞死組織加速傷口愈合，而且能夠獲取深部膿液、壞死病灶等送微生物室培養(yǎng)和病理檢查。該患者最終經(jīng)過(guò)清創(chuàng)、皮瓣移植、抗菌藥物應(yīng)用，3個(gè)月及半年后回訪(fǎng)復(fù)查，患者得以痊愈。

放線(xiàn)菌病在目前的臨床病例中并不常見(jiàn)，其診斷除了需要影像學(xué)、病理學(xué)分析外，更重要的是臨床醫(yī)生能否正確采集膿液、組織標(biāo)本，及時(shí)送檢，為微生物實(shí)驗(yàn)室提供合格標(biāo)本。臨床微生物工作者也需要加強(qiáng)對(duì)放線(xiàn)菌病的認(rèn)識(shí)，有條件是實(shí)驗(yàn)室可適當(dāng)開(kāi)展更可靠的現(xiàn)代診斷方法，如基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、分子生物學(xué)分類(lèi)方法，以便能快速診斷放線(xiàn)菌病并指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理用藥。同時(shí)，本病例提示，在處理感染性疾病時(shí)，除了常見(jiàn)細(xì)菌、真菌、病毒感染外，要警惕少見(jiàn)菌、罕見(jiàn)菌的感染，以免誤診耽誤治療，危及患者生命安全。