蘇州地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定和藥敏相關(guān)性分析

宋華峰，李聲竹，趙 靜，陳興年，唐佩軍，胥 萍

(1.蘇州市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，江蘇蘇州 2150072；2.蘇州市結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 2150073；3.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215007)

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。NTM主要是來(lái)自水源和土壤中，NTM的感染通常是不具有傳染性的，盡管有一些案例記錄了人與人之間的相互傳染。NTM的菌種組成很廣泛，目前已經(jīng)被鑒別出來(lái)的已經(jīng)有大約186種，其中的絕大多數(shù)對(duì)人體健康沒(méi)有危害[1-2]。NTM可侵犯肺部、淺表淋巴結(jié)、皮膚軟組織，甚至播散全身，其中以NTM肺病最為常見(jiàn)。近年來(lái)，NTM感染的報(bào)道在全世界范圍內(nèi)增加，并引起越來(lái)越多的關(guān)注。

NTM的感染發(fā)生率和菌種分布情況存在明顯的地域差異，且NTM具有相當(dāng)高的天然耐藥性。NTM病的治療效果和成功率在很大程度上取決于菌種，不同的NTM菌種耐藥情況不同，治療方案也大相徑庭。由于不當(dāng)?shù)闹委熀洼^高的治療失敗風(fēng)險(xiǎn)，使得NTM感染儼然已經(jīng)成為臨床研究的重要課題[3]。本研究對(duì)蘇州市第五人民醫(yī)院的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，旨在了解NTM在蘇州地區(qū)的菌種分布和耐藥情況，并作臨床相關(guān)性分析，為臨床一線治療NTM病提供更有針對(duì)性的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源 2015-2017年蘇州市第五人民醫(yī)院收集的臨床患者標(biāo)本(包括痰、肺泡灌洗液、尿液等),經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)和對(duì)硝基苯甲酸(PNB)選擇性培養(yǎng)基確定為NTM的標(biāo)本。共收集了128例進(jìn)行過(guò)菌種鑒定的樣本信息，其中128例進(jìn)行過(guò)一線藥敏實(shí)驗(yàn)，102例進(jìn)行過(guò)二線藥敏實(shí)驗(yàn)。128例標(biāo)本來(lái)源主要包括：痰標(biāo)本103例、肺泡灌洗液15例、尿液1例以及蘇州本地縣級(jí)市外送菌株標(biāo)本9例。128例標(biāo)本科室分布主要包括：肺科門(mén)診來(lái)源的46例、肺科病房75例以及其他病區(qū)7例。

1.2儀器與試劑 BACTEC MGIT 960 分枝桿菌分析系統(tǒng)以及配套的 MGIL 培養(yǎng)管(USA,BD 公司)；核酸快速提取儀Extractor36(北京博奧生物集團(tuán)有限公司)，LUXScan10K-B微陣列芯片掃描儀(北京博奧生物集團(tuán)有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)，博奧基因芯片試劑盒(北京博奧生物集團(tuán)有限公司)，Biomixer Ⅱ芯片雜交儀(北京博奧生物集團(tuán)有限公司)，SlideWasher 8芯片洗干儀(北京博奧生物集團(tuán)有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏 分枝桿菌培養(yǎng)采用BACT EC MGIT 960系統(tǒng)，藥敏試驗(yàn)采用改良的羅氏培養(yǎng)法 ；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌與NTM分群主要通過(guò)對(duì)硝基苯甲酸 (PNB) 生長(zhǎng)試驗(yàn)以及觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色等生物特征進(jìn)行區(qū)分，所有步驟嚴(yán)格按照結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程執(zhí)行[4]。

1.3.2菌種鑒定 (1)提取樣本DNA:在核酸提取管中加入50 μL的分枝桿菌核酸提取液，用接種環(huán)刮取適量的菌落放入提取管中，高速振蕩15 min后放入恒溫金屬浴95 ℃加熱15 min。加熱結(jié)束后，將核酸提取管12 000 r/min離心1 min，得到的核酸于-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?2)PCR擴(kuò)增：根據(jù)樣品數(shù)目，在PCR反應(yīng)板中先后加入18 μL PCR擴(kuò)增試劑和2 μL模板DNA或陰、陽(yáng)性對(duì)照品。每份PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL。(3)雜交：將9 μL雜交緩沖液和6 μL PCR產(chǎn)物混合，配制成雜交混合物。雜交混合物95 ℃變性5 min后冰浴3 min。在對(duì)應(yīng)的芯片點(diǎn)陣中加入13.5 μL雜交混合物，蓋好雜交盒后密封。雜交盒置于雜交儀中50 ℃溫育120 min；雜交反應(yīng)結(jié)束后，將芯片取出并用芯片洗滌液進(jìn)行洗滌，甩干然后掃描。

2 結(jié) 果

2.1基因芯片菌種鑒定結(jié)果 經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)初篩的128株NTM，經(jīng)過(guò)基因芯片分枝桿菌鑒定后菌種分布達(dá)6個(gè)種。其中分離率最高的是胞內(nèi)分枝桿菌57.2%(73/128)，其次是堪薩斯分枝桿菌25.0%(32/128)，其余龜/膿腫分枝桿菌11.7%(15/128)、鳥(niǎo)分枝桿菌4.7%(6/128)、偶然分枝桿菌0.7%(1/128)、草分枝桿菌0.7%(1/128)等分離率較低。具體菌種鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 128株NTM 菌種分布情況

2.2NTM藥敏結(jié)果 由于部分患者只做一線抗結(jié)核藥的藥敏試驗(yàn)，故部分NTM菌株耐藥資料不完整。本課題組共收集了128株NTM菌株對(duì)4種一線抗結(jié)核藥(異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇)耐藥情況，以及102株NTM菌株對(duì)4種二線抗結(jié)核藥(左氧氟沙星、對(duì)氨基水楊酸、丙硫異煙胺、阿米卡星)耐藥情況。對(duì)于一線藥物，NTM對(duì)異煙肼和鏈霉素的耐藥率最高，分別到達(dá)了98.4%和95.3%。其次是利福平的耐藥率為72.7%，乙胺丁醇的耐藥率最低為28.9%。對(duì)于二線藥物，NTM對(duì)對(duì)氨基水楊酸和阿米卡星的耐藥率最高，分別為99.1%和90.2%，其次是左氧氟沙星的耐藥率為76.5%，丙硫異煙胺的耐藥率最低為18.6%?？傮w耐藥情況見(jiàn)表2。

表2 NTM總體藥敏情況

2.3各NTM菌種一線藥物的耐藥結(jié)果 分析結(jié)果顯示，胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)鏈霉素、異煙肼以及利福平耐藥率分別為97.3% 、98.6%、 91.8%，耐藥率均大于90%，而對(duì)乙胺丁醇則較為敏感，藥物耐藥率僅為21.9%?？八_斯分枝桿菌對(duì)鏈霉素和異煙肼的耐藥率比較高，分別為90.6% 和96.8%。而對(duì)利福平和乙胺丁醇有較為敏感，耐藥率為12.5%和9.4%；龜/膿腫分枝桿菌對(duì)4種一線抗結(jié)核藥物耐藥率均為100%；鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)鏈霉素和異煙肼具有100%的耐藥性，對(duì)利福平和乙胺丁醇的耐藥率分別為83.3%與33.3%。具體的一線抗結(jié)核藥耐藥情況見(jiàn)表3。

表3 NTM的一線藥物耐藥情況[n(%)]

2.4各NTM菌種二線藥物的耐藥結(jié)果 分析結(jié)果顯示，胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)左氧氟沙星、對(duì)氨基水楊酸以及阿米卡星的耐藥率很高，分別為96.5%、100%、96.5%，耐藥率均大于95%，而對(duì)丙硫異煙胺則較為敏感，藥物耐藥率僅為8.8%?？八_斯分枝桿菌對(duì)對(duì)氨基水楊酸100%耐藥，但對(duì)丙硫異煙胺100%敏感。其對(duì)阿米卡星和左氧氟沙星的耐藥率較低，分別為69.2%和19.2%。龜/膿腫分枝桿菌對(duì)4種二線抗結(jié)核藥物耐藥率均為100%；鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)阿米卡星具有100%的耐藥性，對(duì)左氧氟沙星和對(duì)氨基水楊酸的耐藥率都為80%，而對(duì)丙硫異煙胺耐藥率僅為20%。偶然分枝桿菌丙硫異煙胺敏感，對(duì)其他三種藥物均耐藥。對(duì)具體的二線抗結(jié)核藥耐藥情況見(jiàn)表4。

表4 NTM的二線藥物耐藥情況[n(%)]

3 討 論

近年來(lái)，結(jié)核病疫情逐漸得到控制，NTM的分離率卻呈增高趨勢(shì)，由NTM引起的肺病已經(jīng)在全球范圍內(nèi)得到越來(lái)越多的關(guān)注。一些研究表明NTM的發(fā)病率正在逐步增加，MORIMOTO等[5]估計(jì)，由NTM感染導(dǎo)致的肺部疾病的流行率為35～65/100 000人。由于不當(dāng)?shù)闹委熀洼^高的治療失敗風(fēng)險(xiǎn)，NTM肺病的病死率高達(dá)30%[6]，NTM感染所帶來(lái)的挑戰(zhàn)越來(lái)越嚴(yán)峻。

NTM的感染發(fā)生率和菌種分布情況存在明顯的地域差異，并且與氣候因素有關(guān)。現(xiàn)有的流行病學(xué)資料顯示，我國(guó)NTM感染呈現(xiàn)南方多于北方、沿海地區(qū)多于內(nèi)陸地區(qū)、氣候溫和地區(qū)多于氣候寒冷地區(qū)的特點(diǎn)[7]。本課題組共鑒定出6種NTM，依次為胞內(nèi)分枝桿菌57.2%、堪薩斯分枝桿菌25%、龜/膿腫分枝桿菌11.7%、鳥(niǎo)分枝桿菌4.7%、偶然分枝桿菌0.7%、草分枝桿菌0.7%。YAN等[8]對(duì)江蘇省NTM的流行病學(xué)和地理學(xué)分布也進(jìn)行過(guò)研究，該研究顯示NTM中胞內(nèi)分枝桿菌(68.33%)是主要菌種，均勻分布在江蘇省范圍內(nèi)，龜/膿腫分枝桿菌(13.33%)以及堪薩斯分枝桿菌(6.67%)的分布僅限于于江蘇省部分城市，在蘇州并沒(méi)有分布。本研究結(jié)果與YAN等[8]的分析相比較，胞內(nèi)分枝桿菌均為主要的分離株，兩者相一致。另外，YAN等[8]的研究中在蘇州地區(qū)沒(méi)有龜/膿腫分枝桿菌以及堪薩斯分枝桿菌分布，本研究證實(shí)在蘇州地區(qū)確實(shí)存在，并且占有一定比例，龜/膿腫分枝桿菌百分比11.7%接近全省平均水平13.33%，而堪薩斯分枝桿菌的占比為25%，遠(yuǎn)高于全省平均水平6.67%；同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)了鳥(niǎo)分枝桿菌(1.4%)、偶然分枝桿菌(1.4%)、草分枝桿菌(1.4%)等三種較少見(jiàn)的菌種，補(bǔ)充了江蘇省NTM流行病學(xué)資料，但由于標(biāo)本量過(guò)少，數(shù)據(jù)缺乏代表性，有待繼續(xù)收集相關(guān)資料再做具體討論。

NTM對(duì)常規(guī)抗癆藥物耐藥率相當(dāng)高，本研究顯示，NTM對(duì)鏈霉素、異煙肼、對(duì)氨基水楊酸以及阿米卡星呈現(xiàn)高度的天然耐藥性，耐藥率分別高達(dá)95.3%、98.4%、99.1%、90.2%；其余藥物依次為利福平72.7%、左氧氟沙星76.5%、乙胺丁醇28.9%、丙硫異煙胺18.6%；由此可見(jiàn)乙胺丁醇和丙硫異煙胺對(duì)NTM有較強(qiáng)的抗菌效果。與劉一典[9]等人的報(bào)道相比較，兩項(xiàng)研究中NTM耐藥率均處于較高水平。其研究中耐藥率最高的異煙肼耐藥率為97.6%，本研究中的耐藥率為98.4%，結(jié)果基本一致。另外其研究中鏈霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、利福平、乙胺丁醇的耐藥率都較高，而本研究中上述后兩種藥耐藥率較報(bào)道稍低；差異較大的是乙胺丁醇的耐藥情況，本研究中乙胺丁醇藥物耐藥率為28.9%，而報(bào)道顯示乙胺丁醇耐藥率高達(dá)86.5%。造成這一差異的原因，可能是兩者之間菌株不同，或者是藥敏實(shí)驗(yàn)操作不同。NTM其廣譜耐藥的原因與 NTM 細(xì)胞表面的疏水性及細(xì)胞壁通透屏障相關(guān)，因此有學(xué)者主張治療NTM時(shí)可以將常規(guī)藥物與破壞細(xì)胞壁的藥物或作用機(jī)制不同的其他藥物聯(lián)合使用[10]。

NTM種類很多，不同的菌種之間的耐藥性也存在差異。既往研究顯示，胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素等一線藥物全部耐藥[11]。本研究中胞內(nèi)分枝桿菌對(duì)鏈霉素、異煙肼、利福平呈現(xiàn)出高度耐藥，耐藥率均大于90%，而對(duì)乙胺丁醇則較為敏感。前三種藥物的結(jié)果與金法祥等[12]的研究相一致，而乙胺丁醇的耐藥率與許蘊(yùn)怡等[13]的研究相一致。在二線藥物中，除了對(duì)丙硫異煙胺較敏感外，其余藥物都是高度耐藥?？八_斯分枝桿菌的耐藥則與胞內(nèi)不同，其對(duì)鏈霉素、異煙肼、對(duì)氨基水楊酸這三種藥物表現(xiàn)出高度耐藥，而對(duì)其他藥物比較敏感。也有研究結(jié)果表明，大部分堪薩斯分枝桿菌對(duì)利福平敏感，對(duì)異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素等其余三個(gè)一線藥中度敏感[14]。龜-膿腫分枝桿菌群包括龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、致免疫分枝桿菌等3個(gè)菌種。膿腫分枝桿菌可引起皮膚、肺部等的感染，一般認(rèn)為膿腫分枝桿菌肺病發(fā)病率較低，但GRIFFITH等[15]報(bào)道的153例快速生長(zhǎng)型非結(jié)核分枝桿菌肺病中，有80%為膿腫分枝桿菌感染所致。膿腫分枝桿菌感染治療效果不佳且成功率低，一直是臨床難題。本研究中龜/膿腫分枝桿菌對(duì)8種測(cè)試藥物的耐藥率均為100%，表現(xiàn)出高度的耐藥性。與既往研究結(jié)果吻合[15]。

NTM病治療效果和成功率因NTM菌種而異。本研究表明蘇州地區(qū)流行的NTM主要為胞內(nèi)分枝桿菌。 NTM對(duì)于多種藥物具有高耐藥率，并且不同的NTM的耐藥情況存在差異。所以NTM的治療效果很大程度上取決于機(jī)體所感染的細(xì)菌的種類及耐藥性。及時(shí)對(duì)NTM肺病患者進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)，能夠有效改善患者的治療效果，并且降低患者的身體負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力。