食管癌患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平變化及其臨床意義

袁曉紅，李 鵬，李雨微

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，西安 710014；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安 710061；3.西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心，西安 710061)

食管癌是當(dāng)前臨床上常見的一種疾病，隨著經(jīng)濟發(fā)展和生活方式改變，其發(fā)病率不斷升高。報道表明，食管癌的發(fā)病群體主要為中年群體，并且男性發(fā)病率高于女性群體[1]。我國是世界上食管癌發(fā)病率較高的國家之一，大約每年有15萬人死于食管癌。食管癌的臨床癥狀主要為下咽困難，給患者日常生活帶來了極大不便。因此，應(yīng)探討更有效的治療方法，改善患者病情。研究表明，食管癌與患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平變化存在相關(guān)性，腫瘤能夠?qū)扇苄悦庖咭种埔蜃舆M(jìn)行表達(dá)，并對患者的局部免疫起到抑制作用[3]。T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子是較為常見的調(diào)節(jié)性因子，對患者自身反應(yīng)性T細(xì)胞存在抑制作用，對免疫能力起到了提升作用[4]。本文探討食管癌患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平變化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受治療的28例食管癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]:(1)通過對患者進(jìn)行病理診斷，確診為食管癌；并應(yīng)用由美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)聯(lián)合制定訂的惡性腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤進(jìn)行分期， 0期和ⅠA期為早期，ⅠB～Ⅲ期為進(jìn)展期，Ⅳ期為食管癌晚期；(2)患者在用藥后，沒有取得明顯的效果。排除標(biāo)準(zhǔn)[6]:(1)不愿參與這次研究或臨床數(shù)據(jù)不完善的患者；(2)排除伴有精神疾病的患者；(3)排除多源性腫瘤患者；(4)排除接受化療治療的患者；(5)排除自身免疫障礙患者。食管癌患者為研究組(n=28)，男14例，女14例，年齡56～75歲，平均(61.3±4.2)歲，住院時間12～20 d，平均住院時間(14.3±3.1)d，TNM分期，Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者15例，Ⅲ期患者11例；納入同期本院健康體檢者28例為對照組，男15例，女13例，年齡54～73歲，平均(63.4±4.1)歲。本研究已經(jīng)得到患者同意，一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 首先，在手術(shù)前1 d和手術(shù)第3天,采集患者的空腹靜脈血2 mL，加 5 mL洗滌劑洗滌,離心(1 200 r/min×10 min),倒去上清液,以500 μL洗滌劑懸浮細(xì)胞液。取100 μL細(xì)胞懸液,加20 μL抗細(xì)胞表面抗原的抗 CD3-FITC,渦旋混勻,室溫暗處孵育20 min。然后對細(xì)胞進(jìn)行打孔，加1.5 mL打孔液,離心(1 000 r/min×5 min)。倒去上清液,以100 μL打孔液懸浮細(xì)胞。對細(xì)胞因子進(jìn)行染色：在一管內(nèi)加8 μL抗細(xì)胞因子的單克隆抗體,并另設(shè)一管加10 μL該單克隆抗體的同型抗體。將其放置在4 ℃暗處進(jìn)行孵育大約20 min。加其加入1.5 mL打孔液,對其進(jìn)行離心(1 000 r/min×5 min)。采用流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號：IMMAGE免疫分析儀)和熒光直接標(biāo)記對患者外周血T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子進(jìn)行標(biāo)記[7]。將使用熒光直接標(biāo)記的18 μL單克隆抗體放置到90 μL的抗凝的外周血，并在室溫下對其進(jìn)行孵育大約20 min，并將其加入紅細(xì)胞裂解液，進(jìn)行孵育大約20 min，并對其進(jìn)行洗滌[8]。最后，使用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行相關(guān)檢測，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析[8]。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較兩組外周血T淋巴細(xì)胞與正常值。使用流式細(xì)胞儀對患者抗體進(jìn)行標(biāo)記，并對CD3+進(jìn)行檢測，然后對CD4+/CD8+、CD3+/CD8+、CD3+/CD4+進(jìn)行相應(yīng)的計算。(2)比較兩組外周血CD3+T細(xì)胞分泌因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12表達(dá)水平。(3)比較兩組外周血CD3+T細(xì)胞分泌因子腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(IFN)-γ表達(dá)水平[9]，采集患者靜脈血3 mL，將其靜置，分離取得上層血清，應(yīng)用酶聯(lián)檢測試劑盒，使用ELISA方法對TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血T細(xì)胞值比較 研究組CD3+/CD4+、CD4+/CD8+表達(dá)水平低于對照組，研究組CD3+/CD8+、CD3+表達(dá)水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血T細(xì)胞與正常值比較

2.2兩組IL-2、IL-10、IL-12表達(dá)水平比較 研究組IL-2、IL-10、IL-12表達(dá)水平低于對照組，研究組IL-4表達(dá)水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見表2。

表2 兩組外周血CD3+T細(xì)胞分泌因子表達(dá)

2.3兩組TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平比較 研究組TNF-α表達(dá)水平高于對照組，研究組IFN-γ表達(dá)水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體見表3。

表3 兩組TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平比較

3 討 論

相關(guān)報道表明，我國是食管癌發(fā)病率較高的國家之一。因此，患者出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀時，應(yīng)及時進(jìn)行診斷，避免延誤患者的最佳治療時機。同時，還應(yīng)加強對疾病的防治，制定合理的生活計劃。引起食管癌的原因較多，主要分為化學(xué)病因、生物性病因、缺乏某些微量元素和生活習(xí)慣等[10]。當(dāng)前，對于食管癌的治療主要采取藥物、手術(shù)、化療和放療的方法。盡管上述方法已經(jīng)被廣泛運用，但是目前對患者的治療效果仍十分有限，因此，當(dāng)前的首要任務(wù)是提高對患者的治療效果，保證患者的生活質(zhì)量[11]。細(xì)胞免疫是患者機體抗腫瘤免疫功能的重要組成部分，由T淋巴細(xì)胞為細(xì)胞免疫進(jìn)行介質(zhì)的傳遞，T淋巴細(xì)胞能夠進(jìn)行有效的分化，主要分化為細(xì)胞毒性和輔助性T淋巴細(xì)胞[12]。

而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對免疫細(xì)胞功能的負(fù)調(diào)控細(xì)胞存在較好的抑制作用，對患者機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)起到明顯的抑制作用[13]。通過對食管癌患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平變化及其臨床意義進(jìn)行探討，Th1細(xì)胞分泌INF-r、TNF-α和IL-2細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th1細(xì)胞分泌IL-10和IL-4細(xì)胞因子,對患者體液免疫反應(yīng)進(jìn)行介導(dǎo)[14]。健康患者,Th1/Th2是一種較為平衡的狀態(tài)[15]。在本次研究中，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對患者T細(xì)胞因子IL-2,IL-12,IFN-r,TNF-α、IL-4和IL-10進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)研究組CD3+/CD8+、CD3+表達(dá)水平低于對照組，說明患者此細(xì)胞因子反應(yīng)模式較弱。同時，研究組TNF-α表達(dá)水平高于對照組，TNF-α表達(dá)水平升高沒有達(dá)到有效的抗腫瘤作用，主要原因為TNF-α僅是患者機體進(jìn)行免疫反應(yīng)的一個或某個環(huán)節(jié)。當(dāng)患者的免疫功能受損，TNF-α的抗腫瘤效應(yīng)不能有效作用。

研究結(jié)果顯示，研究組CD3+/CD8+、CD3+表達(dá)水平低于對照組，研究組CD4+/CD8+、CD3+/CD4+表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果充分表明了，食管癌患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子升高，患者的免疫力出現(xiàn)較為明顯的降低。同時研究結(jié)果說明，對患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)檢測，不僅特異度和靈敏度高，同時對患者細(xì)胞免疫功能進(jìn)行有效體現(xiàn)，是患者病情進(jìn)展和免疫狀態(tài)的標(biāo)志物。如果患者機體CD4+細(xì)胞能夠合理地減少或消失，則可改變其對患者腫瘤細(xì)胞的免疫無應(yīng)答性，使得患者非特異性和特異性效應(yīng)細(xì)胞自然發(fā)育，對患者抗腫瘤免疫進(jìn)行有效激活。研究組IL-2、IL-10、IL-12表達(dá)水平低于對照組，研究組IL-4表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。研究組TNF-α表達(dá)水平高于對照組，研究組IFN-γ表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果充分表明了，對食管癌患者外周分泌細(xì)胞因子水平進(jìn)行合理的分析，能夠增進(jìn)對患者發(fā)病機制和免疫調(diào)節(jié)機制的了解，并為患者的治療提供有效的治療依據(jù)，有利于患者疾病的治療，提高患者生活質(zhì)量。對于食管癌患者，食管癌患者外周血CD3+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子CD4+/CD8+、CD3+/CD4+表達(dá)水平顯著增高，說明患者的免疫耐受力與免疫逃逸存在較明顯的關(guān)系。