新生兒腦脊液總膽紅素測定的性能評價

劉 非，邱先桃，陳小娟，蔡敏敏，麻慶玲，龐舒尹，劉海英

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗部，廣東廣州 510623)

新生兒膽紅素腦病是指新生兒發(fā)生高非結(jié)合膽紅素血癥時，游離膽紅素通過血腦屏障，沉積于小腦、延腦、大腦皮質(zhì)及脊髓等部位，能抑制腦組織對氧的利用，從而導(dǎo)致腦損傷，是新生兒高膽紅素血癥嚴(yán)重并發(fā)癥[1-4]。新生兒膽紅素腦病嚴(yán)重威脅新生兒的生命和健康，其病死率及致殘率很高，幸存者75%～90%有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如眼球運動障礙、手足徐動癥、牙釉質(zhì)發(fā)育不全、聽覺障礙和智力低下[5-7]。因此，早期診斷、早期治療是減少后遺癥發(fā)生的關(guān)鍵措施。

目前，臨床上診斷主要根據(jù)臨床表現(xiàn)及血漿總膽紅素濃度和未結(jié)合膽紅素濃度的測定，但是這些指標(biāo)的靈敏度低，往往延誤治療時機。以往的研究顯示腦脊液中膽紅素水平能較好地反映血腦屏障功能狀態(tài)與腦內(nèi)膽紅素水平，并且腦細(xì)胞能量代謝及腦電活動變化程度與腦內(nèi)膽紅素濃度一致，因此，監(jiān)測新生兒腦內(nèi)膽紅素水平，對膽紅素腦病的診斷及病情判斷十分重要[8-13]。

本院檢驗科目前使用的血清總膽紅素檢測系統(tǒng)為日立7600全自動生化分析儀、邁克常規(guī)化學(xué)校準(zhǔn)品和邁克釩酸鹽氧化法血清總膽紅素檢測試劑盒。由于試劑盒本身未聲明可用于腦脊液樣本的檢測，為滿足臨床腦脊液檢測膽紅素的需求，本研究對目前的血清總膽紅素檢測系統(tǒng)進(jìn)行了腦脊液樣本的性能評價。

1 材料與方法

1.1材料來源 由于腦脊液高膽紅素樣本難獲得，且真實值未知，沒有可供比對的參考系統(tǒng)或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用濃度已知的血清膽紅素高值樣本，無色透明腦脊液稀釋后組成實驗樣本。

1.2儀器與試劑 檢測系統(tǒng)為日立7600全自動生化分析儀、邁克常規(guī)化學(xué)校準(zhǔn)品(四川邁克生物股份有限公司，批號：0117011)和邁克血清總膽紅素檢測試劑盒(釩酸鹽氧化法，四川邁克生物股份有限公司，批號：0417031，)。質(zhì)控品采用朗道常規(guī)化學(xué)質(zhì)控品(英國朗道實驗診斷有限公司，批號：766UE和1012UN)。膽紅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值為(108.1±1.9) μmol/L(北京中科質(zhì)檢)。

1.3方法

1.3.1精密度評價 選取稀釋倍數(shù)較高，濃度代表正常值和病理值的樣本各一個，進(jìn)行日間精密度評價。2個實驗樣品各分成20管，每天測定1次，連續(xù)20 d。全部實驗過程均有常規(guī)質(zhì)量控制，在控時檢測實驗樣品，計算20次測量結(jié)果的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(CV)。評價標(biāo)準(zhǔn)以我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定的質(zhì)量指標(biāo)[允許總誤差(TEa)≤15%]為依據(jù)[14]，日間CV≤6%為精密度滿足要求。

1.3.2正確度評價 以稀釋后樣本計算的理論值作為靶值，每個樣品重復(fù)檢測3次，計算每個樣品重復(fù)測量的均值與靶值的相對偏倚。評價標(biāo)準(zhǔn)以我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定的質(zhì)量要求偏倚≤5%為滿足要求，級別為優(yōu)等[14]。

1.3.3準(zhǔn)確度評價 計算在精密度實驗正常值和病理值濃度處的實驗總誤差(TE)，TE=|偏倚|+2CV，并評價準(zhǔn)確度的西格瑪(σ)水平，σ=(TEa-|偏倚|)/CV。

1.3.4分析測量范圍評價 以線性稀釋回收法進(jìn)行分析測量范圍評價。等間距混合高值(H)和低值(L)樣本，根據(jù)低濃度樣品和高濃度樣品配制比例關(guān)系計算各個樣品的理論值，實際測量結(jié)果為實測值，以理論值為X，實測均值為Y，進(jìn)行直線相關(guān)與回歸分析，若R2≥0.975，b與1差異無統(tǒng)計學(xué)意義(通常在0.97～1.03)，a和0差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可判斷為線性；再按以下公式計算稀釋回收率，稀釋回收率=(實測值/理論值)×100%，允許稀釋偏差為7.5%(1/2TEa)，各樣品稀釋回收率在92.5%～107.5%為可接受。此時實驗所選擇濃度即為分析測量范圍。若上述任何一項不滿足條件，則去掉最高數(shù)據(jù)點重新實驗。

回收試驗：將膽紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液以無色透明腦脊液稀釋，一般檢驗方法要求回收率在95%～105%之間，最為理想的回收率應(yīng)是100%。加入標(biāo)準(zhǔn)液的體積控制在整個反應(yīng)液體積的10%以內(nèi)，最好使實驗標(biāo)本的被測定濃度達(dá)到醫(yī)學(xué)決定水平。加入濃度計算：加入濃度(μmol/L)=標(biāo)準(zhǔn)液濃度×[標(biāo)準(zhǔn)液量(mL)/實驗樣本總量(mL)]；回收濃度(μmol/L)=回收樣品測得濃度-基礎(chǔ)樣品測得濃度；回收率計算：回收率=回收濃度/加入濃度×100%

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用R語言3.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計，其中分析測量范圍數(shù)據(jù)，用lm函數(shù)進(jìn)行線性回歸。

2 結(jié) 果

2.1日間精密度評價 選擇膽紅素濃度為133.4 μmol/L的血清，用無色透明腦脊液樣本進(jìn)行1∶20和1∶10倍稀釋，2個樣本的濃度分別接近6.5 μmol/L(接近報道的正常值上限)和13.5 μmol/L(病理值)。 正常值和病理值濃度處的日間CV均小于行標(biāo)規(guī)定的最佳精密度要求(6%)，滿足質(zhì)量要求，見表1。

表1 日間精密度實驗結(jié)果

2.2正確度評價 根據(jù)文獻(xiàn)報告，選擇臨床上有意義的腦脊液膽紅素濃度區(qū)間，以計算的理論值作為靶值，計算每個樣品重復(fù)測量的均值與靶值的相對偏倚，結(jié)果見表2。平均偏倚為-1.18%，小于允許偏倚(5%)，并且每個樣本的偏倚均小于允許偏倚，滿足質(zhì)量要求。

2.3準(zhǔn)確度評價 根據(jù)接近正常值和病理值濃度的CV和相對偏倚，計算出的TE分別為7.40%和4.01%，均小于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的15%；根據(jù)TEa、CV和相對偏倚計算出σ值分別為6.5和10.9，均達(dá)到了優(yōu)秀。

表2 已知理論濃度的稀釋樣品測量結(jié)果(μmol/L)

2.4分析測量范圍評價 選擇濃度為25.1 μmol/L的高值樣本(H)和濃度為1.0 μmol/L的低值樣本(L)各1份，制備成七個等間距的實驗樣本(6H、5H+1L、4H+2L、3H+3L、2H+4L、1H+5L、6L)，按實驗方法重新測定，繪制散點圖，見圖1。計算回歸方程和回歸系數(shù)R2，R2=0.999 7，b=0.990 9，在0.97～1.03之間，α=0.137 8，與0差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.074,P=0.332)，因此判定為線性。計算每個樣品的稀釋回收率，見表3。回收率為96.0%～101.5%，均在評價標(biāo)準(zhǔn)92.5%～107.5%，因此實驗所選擇的濃度1.0～25.1 μmol/L即為分析測量范圍。

圖1 實測均值與預(yù)期值散點圖

表3 線性稀釋回收率計算

2.5回收試驗 回收樣品制備：(1)基礎(chǔ)樣品：無色透明腦脊液0.9 mL+0.1 mL蒸餾水；(2)回收樣品Ⅰ：無色透明腦脊液0.9 mL+0.1 mL 108.1 μmol/L膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液；(3)回收樣品Ⅱ：無色透明腦脊液0.9 mL+0.05 mL 108.1 μmol/L膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液+0.05 mL蒸餾水。混勻，平衡30min后檢測。2個回收試驗樣本的回收率均在95%～105%，說明檢測系統(tǒng)對于腦脊液基質(zhì)中膽紅素檢測，不受基質(zhì)效應(yīng)影響。見表4。

表4 膽紅素回收試驗結(jié)果(μmol/L)

3 討 論

高膽紅素血癥患兒發(fā)生膽紅素腦病主要取決于腦內(nèi)膽紅素水平，血清總膽紅素水平越高，游離膽紅素水平就越高，通過血-腦屏障進(jìn)入腦組織的可能性就越大，也容易導(dǎo)致膽紅素腦病的發(fā)生。腦脊液膽紅素水平可更好地反映血-腦屏障功能狀態(tài)和腦內(nèi)膽紅素水平。

目前，醫(yī)學(xué)實驗室膽紅素檢測一般使用生化分析儀，且只檢測血清標(biāo)本，檢測試劑盒生產(chǎn)廠家說明書通常不會聲明可用于腦脊液膽紅素檢測。為滿足臨床的客觀需求，現(xiàn)有的膽紅素檢測系統(tǒng)進(jìn)行臨床腦脊液標(biāo)本檢測前，必須要進(jìn)行性能確認(rèn)。需要評價檢測系統(tǒng)的精密度、正確度、準(zhǔn)確度、分析測量范圍和參考區(qū)間等指標(biāo)。

本研究選擇分別代表病理值和正常值的兩個濃度水平進(jìn)行精密度實驗，結(jié)果表明日間CV小于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，甚至小于1/6行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的TEa(15%/6=2.5%)，精密度達(dá)到了最佳的質(zhì)量要求。

正確度評價時，因無法獲得可供比對的參考系統(tǒng)或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本研究在檢測系統(tǒng)經(jīng)過校準(zhǔn)，且檢測原衛(wèi)生部能力驗證樣本控制在偏倚<5%的前提下，檢測血清膽紅素樣本，獲得高值血清樣本，以無色透明腦脊液進(jìn)行5倍稀釋，檢測稀釋后樣本，確認(rèn)無明顯的基質(zhì)效應(yīng)后，作為腦脊液工作樣本高值(H)，此高值樣本與無色透明低值腦脊液樣本(L，濃度為1.0 μmol/L)等間距稀釋后的理論值作為靶值。結(jié)果表明在1.0～25.1 μmol/L濃度范圍內(nèi)，偏倚為-4.00%～1.53%，平均偏倚為-1.18%，小于允許偏倚(5%)，滿足質(zhì)量要求。并且，根據(jù)病理值和正常值濃度處的不精密度和偏倚算的TE均小于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，σ值小于5，準(zhǔn)確度達(dá)到優(yōu)秀。

根據(jù)文獻(xiàn)[15]報道的腦脊液膽紅素水平，本課題組選擇在小于25 μmol/L濃度范圍內(nèi)評價檢測系統(tǒng)的線性，結(jié)果表明腦脊液膽紅素檢測系統(tǒng)的分析測量范圍可覆蓋1.0～25.1 μmol/L，稀釋回收率滿足質(zhì)量要求。

文獻(xiàn)報道，正常足月新生兒，腦脊液膽紅素平均為(4.10±1.71)μmol/L或(4.3±1.4)μmol/L，上限均接近7.5 μmol/L[15]。因此，暫定新生兒腦脊液膽紅素參考區(qū)間為<7.5 μmol/L，需進(jìn)一步通過正常組腦脊液樣本進(jìn)行驗證。

4 結(jié) 論

腦脊液膽紅素測定可協(xié)助臨床更早期預(yù)測和發(fā)現(xiàn)新生兒膽紅素腦病，及時干預(yù)。本研究通過對現(xiàn)有檢測系統(tǒng)的精密度、正確度、準(zhǔn)確度和分析測量范圍進(jìn)行評價，證明在1.0～25.1 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，檢測系統(tǒng)的日間CV，偏倚，TE均能滿足質(zhì)量要求，現(xiàn)有檢測系統(tǒng)可用于腦脊液膽紅素的測定。