甲殼動物造血機制研究進展

楊 豐， 李 鈁

(自然資源部第三海洋研究所、海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005)

血細胞是甲殼動物的免疫細胞，負責執(zhí)行體液免疫和細胞免疫，抵御和清除入侵的病原。保證循環(huán)系統(tǒng)中血細胞的穩(wěn)態(tài)是維持一個有效免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)。成熟血細胞均具有一定的壽命，在正常生理條件下需要不斷更新；在發(fā)生感染的情況下，血細胞被大量招募用于清除病原，會在短時間內(nèi)產(chǎn)生較多的損耗；此外，由于甲殼動物好斗的特性，常常會發(fā)生外傷導致血細胞流失；以上情況都需要造血組織(hematopoietic tissue)產(chǎn)生新的血細胞來加以補充。因此活躍的造血能力，對保證機體的健康乃至存活都是非常重要的。相對脊椎動物而言，人們對無脊椎動物造血(hematopoiesis)機制的認識很有限，本文對近年來在甲殼動物造血機制的研究上取得的進展進行了總結(jié)。

1 甲殼動物血細胞的類型與功能

1.1 血細胞的類型

甲殼動物的血細胞根據(jù)形態(tài)特征可大致分成3類：透明細胞(hyaline/agranular cell, HC)，半顆粒細胞/小顆粒細胞(semigranular cell/small granular cell, SGC)和顆粒血細胞/大顆粒細胞(granular cell/large granule cell, GC)[1-2]。其中HC體積最小，核質(zhì)比最大，細胞中不含或者含有少量的胞質(zhì)顆粒；GC體積最大，核質(zhì)比最小，細胞質(zhì)中充滿了體積較大的顆粒；SGC體積中等，核質(zhì)比較小，含有較多胞質(zhì)顆粒，但是其顆粒的體積小于GC[3]。研究表明，在不同的物種中，血細胞的類型組成以及不同類型細胞的豐度存在一定的差異。在螯蝦和對蝦中，SGC和GC是主要的血細胞，而HC含量較低，研究者認為其可能是提前被釋放的未充分分化的細胞[3-5]；但對一些蟹類的研究表明HC是主要的血細胞[6]。這種根據(jù)形態(tài)學特征來區(qū)分細胞類型的方法比較原始、主觀性強，因此研究者對不同物種血細胞類型的判別，甚至不同研究者針對同一物種的血細胞類型判別均可能存在差異。

1.2 血細胞功能

血細胞是甲殼動物的主要免疫細胞，負責執(zhí)行細胞免疫和體液免疫反應。其中細胞免疫主要包括對外來異物的吞噬、包囊、結(jié)節(jié)作用[1, 7]；體液免疫主要包括酚氧化酶原系統(tǒng)參與的黑化過程、凝固蛋白參與的凝血反應，以及抗菌肽對病原的殺傷等[8-10]。已有的研究表明，不同類群的細胞在免疫反應中扮演不同的角色。其中HC、SGC和GC均可參與對異物的吞噬；SGC負責執(zhí)行對較大異物的包囊作用；GC是酚氧化酶酶系的主要儲存細胞，在一定條件下GC中的酚氧化酶酶系被釋放并活化，啟動黑化反應；此外，GC還負責儲存和釋放抗菌肽、蛋白酶抑制劑等免疫活性物質(zhì)[1, 10]。

1.3 有待解決的問題

目前對血細胞功能的研究主要以血細胞的形態(tài)學分類為基礎(chǔ)。然而，同樣的形態(tài)學類群中可能還存在不同的功能亞群[5]。對血細胞功能亞群的鑒定，以及準確的血細胞分型，將有賴于血細胞分子標記的發(fā)現(xiàn)，以及基于分子標記的細胞功能分析。近年來有研究者依據(jù)血細胞的形態(tài)學分類，從mRNA和蛋白水平對相應的分子標記進行了篩選，獲得了一些在不同血細胞中特異性表達的標記分子，為研究甲殼動物血細胞功能分型奠定了基礎(chǔ)[11-13]。但這些標記分子與血細胞功能亞群的對應關(guān)系，以及在不同甲殼動物中的適用性還有待進一步研究。

2 甲殼動物的造血組織

造血指的是從造血干細胞/前體細胞分化產(chǎn)生成熟血細胞并釋放到血液循環(huán)的過程。人們對甲殼動物造血機制的探索可追溯到18世紀末，早期的研究者憑借顯微觀察在多種甲殼動物中發(fā)現(xiàn)了造血組織存在的證據(jù)[3]。近年來的研究主要集中在十足目甲殼類動物特別是淡水螯蝦中[3, 14-19]，此外在對蝦[20-23]、蟹類[24-26]、龍蝦[27]中也進行了一些探索。十足目甲殼動物的造血組織通常位于胃部背側(cè)，是一薄片狀組織，造血干細胞/前體血細胞被包裹在由結(jié)締組織構(gòu)成的小葉中。

2.1 造血組織細胞的類型

研究者根據(jù)造血組織小葉中細胞的形態(tài)學特征(包括細胞大小、胞質(zhì)顆粒以及細胞器發(fā)育情況等)，對其進行了初步的分類，并對細胞所處分化階段進行了推測。

Chaga等(1995)認為，螯蝦(Pacifastacusleniusculus)的造血組織包括了5種類型的細胞[14]。其中1型和2型細胞均具有分裂能力，可分化為SGC與GC。1型細胞可能是造血干細胞，占8%左右，這類細胞排列緊密的分布于小葉背側(cè)，可進一步發(fā)育為2型細胞；2型細胞占總數(shù)30%左右，緊鄰1型細胞層分布在小葉內(nèi)側(cè)，細胞的組織比較松散，這類細胞增殖最為旺盛。3型和4型細胞含有與GC類似的顆粒，可能是GC的前體，其中3型細胞含量最高，占55%。5型細胞含有很多細小的胞質(zhì)顆粒，可能是SGC的前體。3、4、5型細胞均不具備分裂能力。

Martin等(1993)認為，龍蝦(Homarusamericanus)的造血組織中包含了兩個譜系的干細胞和成熟血細胞[27]。其一是透明細胞譜系，包括透明型干細胞，以及處于不同分化階段的透明細胞；其二是顆粒細胞譜系，根據(jù)不同的分化階段，分為顆粒型干細胞、小顆粒型干細胞、小顆粒細胞、顆粒細胞。每個小葉通常同時包含兩個譜系的細胞。在造血組織中透明細胞譜系占9.5%，顆粒細胞譜系占90.5%。

Van de Braak等(2002)認為，對蝦(Penaeusmonodon)的造血組織包含了4種主要的細胞類型[20]：1型細胞是前體細胞，可進一步分化為2型(未成熟SGC)和3型(未成熟GC)細胞，而4型細胞為間質(zhì)細胞。其中1～3型細胞均可分裂。作者認為造血組織中的2、3型細胞與傳統(tǒng)意義上血液循環(huán)中的HC類似，推測2、3型細胞以HC的形式被釋放后，在循環(huán)中成熟為SGC和GC。其中部分GC可能在結(jié)締組織中分化成熟并儲存。需要指出的是，早期研究認為類淋巴器是對蝦的造血組織，后來這個觀點被證明是錯誤的，類淋巴器可能是一個血淋巴的過濾器官，負責過濾收集循環(huán)血中的病原，并通過活躍的吞噬作用將其清除[28]。

2.2 造血組織中細胞的組織形式

根據(jù)對螯蝦[14]、對蝦[20]、龍蝦[27]等的研究，十足目甲殼動物造血組織小葉中細胞的組織形式存在類似的規(guī)律。造血組織小葉結(jié)構(gòu)具有極性，在其一側(cè)存在開口(結(jié)締組織缺失)。小葉中的細胞按分化程度呈梯度分布：分化程度低的細胞緊密排列于遠離開口的一側(cè)(在螯蝦中描述為小葉的背側(cè)，在對蝦中描述為小葉的外周)；分化程度較高的細胞松散排列于小葉的內(nèi)部；即將成熟的血細胞位于小葉開口附近，并可能由此處釋放到循環(huán)中。此外，對螯蝦的研究表明，位于造血組織不同部位的細胞存在差異，螯蝦造血組織的前端與大腦相鄰的部位存在一個復制中心(anterior proliferation center, APC)[29]。與造血組織后部相比，APC細胞分化程度較低、增殖旺盛。從該部位分離的細胞在體外培養(yǎng)實驗中也與來源于造血組織后部的細胞存在差異，細胞因子Astakine 1在體外無法誘導APC細胞的分化。推測APC可能是造血干細胞集中分布之處。

2.3 有待解決的問題

已有的研究僅是基于形態(tài)學特征對甲殼動物的造血組織細胞進行了類型區(qū)分，并根據(jù)其胞質(zhì)顆粒的有無和多少以及細胞器發(fā)育情況等將其與循環(huán)血細胞對應關(guān)聯(lián)。至于這些細胞之間以及它們與循環(huán)血細胞類型之間的關(guān)系還缺乏直接的證據(jù)。

3 血細胞的分化途徑

甲殼動物血細胞的分化途徑目前是不明確的。研究者推測，螯蝦和對蝦的血細胞可能是雙向分化，即：造血干細胞先分別分化為SGC和GC的前體，然后再進一步發(fā)育為SGC和GC[14, 20]，但是這一推測尚缺乏實驗證據(jù)。根據(jù)我們的研究，螯蝦血淋巴中GC的比例通常小于35%，但體外培養(yǎng)的螯蝦造血組織細胞中有60%以上具有分化為GC的能力，而且未成熟GC的形態(tài)特征與循環(huán)中的SGC非常類似[17]。上述發(fā)現(xiàn)提示血細胞也存在單向分化的可能，即只有一種細胞譜系，分化途徑是造血干細胞-前體血細胞-SGC-GC。此外，對螯蝦[14]、對蝦[20]和龍蝦[27]造血組織的形態(tài)學研究表明，該組織中不含(或僅含有極少量的)成熟GC，且這些極少量的GC可能是由血淋巴攜帶進組織的。因此，GC應該是分化到一定階段就被釋放到血液循環(huán)并在其中逐步發(fā)育成熟的。血淋巴中含有多大比例的未成熟GC，這些細胞如何進一步發(fā)育也是未知的。因此甲殼動物血細胞的分化途徑到底如何還需要更深入的研究。

4 甲殼動物造血的調(diào)控機制

4.1 參與造血調(diào)控的分子

甲殼動物的造血過程受到蛻皮周期[27, 30]、病原感染[20, 31-33]、失血[20, 34]以及晝夜節(jié)律等因素[35]的影響。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些蛋白可能參與了甲殼動物造血的調(diào)控，其中最重要的是細胞因子Astakine。Astakine是一類與脊椎動物Prokineticin同源的蛋白。Prokineticin類蛋白參與了脊椎動物的血管生成、神經(jīng)生成，以及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等過程[19]。目前在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)了兩種類Astakine亞型， Astakine1和Astakine2 (簡稱AST1，AST2)。AST1是一類造血組織生長因子，主要由SGC產(chǎn)生并分泌到血淋巴中。AST1在體外可以促進造血組織細胞的增殖，注射AST1則可以引起循環(huán)血細胞的增加，而抑制AST1的表達則會阻礙新血細胞的產(chǎn)生[33]。內(nèi)外實驗均表明，AST1可能具有誘導造血組織細胞分化為SGC的能力[36]。不僅如此，AST1還可以通過上調(diào)甲殼動物造血因子(crustacean hematopoietic factor，CHF)的表達來抑制造血組織細胞的凋亡[37]。因此AST1可通過促增殖和抑凋亡兩個途徑來增強機體的造血能力。此外，其他一些造血調(diào)節(jié)因子可能通過與AST1相互作用來發(fā)揮功能，例如：AST1和β胸腺素都能結(jié)合細胞表面的ATP合成酶, AST1可以促進胸腺素的分泌，胸腺素又可以促進AST1的表達，二者通過復雜的相互作用影響造血組織細胞的增殖、遷移和釋放[38-39]；抗菌肽Crustin Pm4以及轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase, TGase)可以通過結(jié)合AST-1的3’-UTR抑制AST1蛋白的翻譯[23]；五羥色胺可以通過促進血細胞分泌AST1來調(diào)節(jié)造血組織細胞的增殖[18]。

與AST-1不同， AST2不能促進血細胞的增加，但它可以引起血淋巴中GC比例的上升，因此該蛋白可能與GC分化成熟有關(guān)[36]。此外，AST2在造血組織中的表達受晝夜節(jié)律影響顯著，并可以介導褪黑素對生物鐘的調(diào)節(jié)，可能參與調(diào)控造血的晝夜節(jié)律變化[35]。

此外在對蝦中還發(fā)現(xiàn)了一個血細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子(hemocyte homeostasis-associated protein，HHAP)，該蛋白在造血組織中高表達，敲低其表達會導致血細胞發(fā)生嚴重損傷，并導致對蝦在30 h之內(nèi)迅速死亡[21]。說明HHAP對維持對蝦循環(huán)血細胞穩(wěn)態(tài)非常重要，可能與造血能力的維持有關(guān)。不過在螯蝦發(fā)現(xiàn)的HHAP同源蛋白并不具有上述功能[40]。

4.2 胞外基質(zhì)與造血的關(guān)系

對脊椎動物的研究表明，胞外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)造血組織/器官的微環(huán)境，影響造血干細胞/前體血細胞的增殖、更新與分化等過程[41]。螯蝦的造血組織細胞是由結(jié)締組織包裹，胞外基質(zhì)的主要成分包括膠原蛋白[3, 14]和凝血蛋白[42]等，它們共同維持造血組織的微環(huán)境，影響造血干細胞/前體血細胞的分化狀態(tài)。TGase在調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)中扮演了重要的角色。TGase是一類負責催化甲殼動物凝血過程的酶，它能催化蛋白質(zhì)賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)之間發(fā)生共價交聯(lián)。TGase在甲殼動物的造血組織中高表達[16, 22]，在對螯蝦造血組織塊的體外培養(yǎng)中研究者發(fā)現(xiàn)，組織內(nèi)部的TGase表達量很高，而從組織塊外遷的細胞TGase表達量顯著降低；而抑制TGase表達會引起原代造血組織細胞的形態(tài)發(fā)生改變[16]。上述發(fā)現(xiàn)說明TGase在維持造血組織細胞干性方面可能有一定的作用。進一步的研究表明，AST1可以非競爭性抑制TGase的活性，導致胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，從而促進造血組織細胞的分化和新生血細胞釋放[19]。此外，血小板生成因子/血管內(nèi)皮生長因子(platelet-derived growth factor/vascular endothelial growth factor)家族的蛋白也可以通過抑制TGase來調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而促進血細胞的分化[43]。

4.3 有待解決的問題

在上述對甲殼動物造血調(diào)控機制的研究中，研究者主要是根據(jù)原代造血組織細胞的貼壁鋪展和遷移情況來判斷其是否分化，缺乏直接證據(jù)。此外，在上述研究中，對于有新血細胞產(chǎn)生的判斷標準是循環(huán)血細胞數(shù)量的增加，無法排除固著血細胞[44-47]釋放產(chǎn)生的影響。因此，到底哪些因子在血細胞分化、成熟和釋放的過程中起到調(diào)控作用還有待進一步證實。

5 造血組織細胞的體外培養(yǎng)與誘導分化

2005年瑞典學者建立了螯蝦造血組織細胞體外培養(yǎng)的方法[33]。他們利用膠原酶將造血組織消化，得到單細胞懸液，并于添加了螯蝦血漿的L15培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。造血組織細胞存活時間可達8～12周。隨后，他們從螯蝦血漿中分離出能夠促進造血組織細胞增殖和分化的細胞因子AST1[33]。Liu等(2007)利用組蛋白H2A為轉(zhuǎn)染試劑，建立了適用于螯蝦造血組織細胞的RNA干擾技術(shù)[48]。此后原代培養(yǎng)的螯蝦造血組織細胞被廣泛用于造血機制和免疫功能的研究[16, 37, 49-51]。Shi等(2018)建立了基于這一原代培養(yǎng)細胞的外源基因轉(zhuǎn)染方法[52]，進一步為開展基因功能研究提供了便利。本課題組Li等(2019)利用螯蝦肌肉提取液成功的誘導體外培養(yǎng)的造血組織細胞分化為GC[17]，建立了甲殼動物血細胞分化的體外模型，為深入研究甲殼動物血細胞分化掃除了技術(shù)障礙。

6 展望

雖然近年來對甲殼動物造血機制的研究取得了較大的進展，但是還有許多基本的問題懸而未決。比如：造血組織中到底存在哪些不同分化階段的細胞，它們與循環(huán)血細胞之間到底是什么關(guān)系？血細胞的分化途徑是怎樣的，受哪些因子的調(diào)控？血細胞分化成熟及新舊更替的速度如何？病原感染對造血過程有何影響？對這些問題的探究將深化我們對甲殼動物造血機制的認識，并有助于了解動物造血機制的演化過程。