去細(xì)胞組織水凝膠化的研究進(jìn)展

黎 婷

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院， 安徽 蕪湖 241003)

0 引 言

水凝膠是含水量高的高分子多聚鏈化合物材料(含水量>30%)，多聚鏈通過(guò)物理和化學(xué)的交聯(lián)作用保持結(jié)構(gòu)的完整性[1]，可以是合成物，如聚乙烯氧化物(PEO)、聚乙烯乙醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)等等，或者是天然材料，如藻朊酸鹽、殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸等。合成及天然的水凝膠均被廣泛用于填充缺陷部位空隙、傳遞生物活性分子或藥物、傳遞細(xì)胞來(lái)刺激組織生長(zhǎng)[1]。

利用細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)組分也可制備水凝膠，例如膠原、透明質(zhì)酸和彈性蛋白等。通過(guò)酶促溶解獲得的哺乳動(dòng)物ECM，不容易受到生理pH值和溫度的影響，因此部分去細(xì)胞組織具有“類(lèi)水凝膠”結(jié)構(gòu)，卻不易溶解，例如脂肪組織提取物、椎間盤(pán)、軟骨等，屬于保留了全部生化復(fù)雜性功能的天然材料，且避免了人工材料的致癌風(fēng)險(xiǎn)[1]。時(shí)至今日，ECM水凝膠已經(jīng)被初步用于3D器官培養(yǎng)模型和傷后刺激組織生長(zhǎng)。該綜述就是描述ECM水凝膠的形成、利用、物理和生物學(xué)特征，以及在未來(lái)的研究方向和ECM水凝膠臨床移植的探討。

為什么選擇ECM？

ECM是由構(gòu)成各種組織的細(xì)胞所分泌的大量結(jié)構(gòu)和功能分子成分所構(gòu)成，每種組織ECM的3D結(jié)構(gòu)和生物學(xué)組成都顯著不同。ECM影響細(xì)胞行為、活力和相互作用，在過(guò)去的幾十年，構(gòu)建生物材料都是從各方面去模仿ECM的結(jié)構(gòu)和構(gòu)成，以期主動(dòng)影響細(xì)胞行為[2]。近百篇的文獻(xiàn)報(bào)道了水凝膠在幾乎全身各個(gè)器官的應(yīng)用，雖然ECM水凝膠調(diào)控細(xì)胞行為的機(jī)制仍需研究，但其中包含的各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子、多肽類(lèi)活性物質(zhì)，與ECM水凝膠的生物活性不可分割[3]。

1 ECM水凝膠的制備

水凝膠的形成基于膠原自身聚合，可被粘多糖、蛋白聚糖和ECM蛋白調(diào)節(jié)，在原始組織材料中的天然生化物質(zhì)以及去細(xì)胞和溶解后保留在組織中的蛋白質(zhì)，會(huì)影響組織的高分子聚合動(dòng)力。原始材料通過(guò)充分去細(xì)胞保留ECM組成成分和超微結(jié)構(gòu)，而ECM溶解的方法對(duì)形成ECM水凝膠至關(guān)重要。最初從豬膠原含量高的組織制備ECM，如脂肪和肌腱。水凝膠的制備有2個(gè)關(guān)鍵步驟：①ECM材料溶解成蛋白單體成分；②pH值保持在中性時(shí)，ECM的單體成分能夠通過(guò)分子內(nèi)氫鍵自發(fā)重組而形成均質(zhì)凝膠。常用的ECM水凝膠制備法是利用胃蛋白酶降解實(shí)質(zhì)部分(可達(dá)99%，又稱(chēng)為ECM消化)，通過(guò)打斷膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的端肽獲得線性聚合物，即用0.1M HCl或者用0.5M乙酸溶解胃蛋白酶后， ECM經(jīng)攪拌消化48h，消化完全的標(biāo)準(zhǔn)是均質(zhì)液體中沒(méi)有可視顆粒。不同的消化方法和消化時(shí)間會(huì)產(chǎn)生不同的生物活性產(chǎn)物，因此，針對(duì)不同的臨床應(yīng)用需要不同的消化方法。當(dāng)膠原單體失水，或者膠原纖維隱藏表面的疏水殘基，就會(huì)加快ECM水凝膠均質(zhì)化的過(guò)程[4]。制備好的ECM預(yù)凝膠要低溫保存，使用前再凝膠化。不同于純膠原水凝膠在4～37 ℃均可凝膠化，在低于22 ℃時(shí)，ECM材料的凝膠化受到抑制。

在生理pH下，可以利用軟組織制備ECM水凝膠，使用高鹽緩沖液破壞ECM微粒和膠原纖維結(jié)構(gòu)，再通過(guò)均化作用將蛋白和糖蛋白萃取出來(lái)，即使用中性蛋白酶打斷纖維蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、消化ECM，再使用尿素萃取進(jìn)一步打斷非共價(jià)鍵，增加ECM蛋白溶解度，離心后棄除沉淀即可[4]。

2 ECM水凝膠特性

不同組織、不同處理過(guò)程會(huì)影響ECM水凝膠的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特性、力學(xué)特性和生物性能。

2.1 生化組成

ECM由結(jié)構(gòu)、功能蛋白的復(fù)雜混合物組成，去細(xì)胞和溶解的方法適當(dāng)，這些混合物被大量保留，但酶促溶解過(guò)程會(huì)改變ECM水凝膠的蛋白結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，與使用胃蛋白酶消化制備的肺ECM相比，預(yù)凝膠中的蛋白分子量更小，因?yàn)槲傅鞍酌复傧鬀](méi)有萃取和純化，小分子蛋白得以保留[5]。

盡管有相似性，每個(gè)組織和器官的ECM組成還是有顯著差別，例如腦ECM中可溶膠原含量比膀胱基質(zhì)(Urinary bladder matrix，UBM)和脊髓ECM中相比顯著減少，真皮ECM的可溶膠原含量比UBM顯著增加，而脊髓和真皮ECM的硫酸粘多糖含量比UBM低。不同物種的相同組織ECM含量也有差別。通常使用質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)ECM水凝膠中的生化組成，使用高效液相色譜儀檢測(cè)胃蛋白酶法溶解的水凝膠中的蛋白組學(xué)，并與蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)組織蛋白的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，目前已經(jīng)獲得了肝、骨骼肌、肌腱、心、腎、胰腺和臍帶等組織的分析數(shù)據(jù)[5]。

2.2 凝膠的超微結(jié)構(gòu)

天然ECM結(jié)構(gòu)是由纖維結(jié)合蛋白多糖和粘多糖共同構(gòu)成的3D網(wǎng)絡(luò)，纖維直徑、孔隙大小和纖維方向都會(huì)影響細(xì)胞行為。在去細(xì)胞和溶解過(guò)程中，膠原纖維結(jié)構(gòu)被打破，會(huì)損失一部分天然纖維網(wǎng)絡(luò)。膠原單體會(huì)自動(dòng)聚集成纖維狀的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但在預(yù)凝膠溶液中無(wú)法聚集。SEM可將凝膠的立體結(jié)構(gòu)可視化，顯示ECM水凝膠的疏松納米纖維排列和空隙結(jié)構(gòu)，而自動(dòng)高通量分析可將SEM圖片中水凝膠的纖維直徑、孔隙大小和纖維排列量化。UBM水凝膠平均纖維直徑為74nm，不同組織來(lái)源的ECM水凝膠平均纖維直徑為100nm。ECM的一些天然結(jié)構(gòu)特征也會(huì)在ECM水凝膠中保留，例如臍帶原始的基底膜和臍帶ECM水凝膠的孔隙大小、纖維直徑都很相似[6]。

2.3 力學(xué)性能

低粘度的預(yù)凝膠溶液和適度的凝膠化動(dòng)力能最低限度引起機(jī)體的攻擊。在體外培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，基質(zhì)硬度會(huì)影響干細(xì)胞的分化和功能，還會(huì)影響體內(nèi)微環(huán)境的重構(gòu)，因此ECM水凝膠對(duì)微環(huán)境中干細(xì)胞分化和微環(huán)境重構(gòu)是依賴于水凝膠的性能，預(yù)凝膠的粘度、凝膠化動(dòng)力和凝膠硬度這三項(xiàng)性能，不僅影響注射后缺陷部位凝膠的保留度，還會(huì)影響注射凝膠組織周?chē)z的彌散度[6]。

目前主要用濁度滴定法和流變學(xué)測(cè)定ECM粘性性能。凝膠動(dòng)力學(xué)顯示，UBM水凝膠和純化的膠原Ⅰ型凝膠、骨及軟骨、脊髓ECM水凝膠的凝膠指數(shù)都是S形，而腦ECM水凝膠動(dòng)力學(xué)指數(shù)是呈指數(shù)增長(zhǎng)，造成區(qū)別的原因就是由于前者粘性性能要比后者高。流變學(xué)是用來(lái)測(cè)定水凝膠硬度的典型方法，還可以顯示預(yù)凝膠的粘度和凝膠化的時(shí)間。ECM預(yù)凝膠是低粘度溶液，但粘度會(huì)隨著預(yù)凝膠的蛋白濃度增加。保存ECM預(yù)凝膠時(shí)，將溫度從4℃提高到37℃，測(cè)定結(jié)果顯示凝膠化時(shí)性能發(fā)生變化。例如UBM、骨、肝和真皮ECM水凝膠逐漸增加濃度時(shí)，凝膠化的速率也提高了[6]。

另一個(gè)設(shè)計(jì)ECM水凝膠的重要標(biāo)準(zhǔn)就是注射能力，注射能力和粘性性能相關(guān)(ECM粘度和凝膠化時(shí)間)。心、脊髓、小腸、臍帶、骨骼肌、肌腱、真皮、肺、肝、軟骨、膀胱和脂肪等組織器官ECM水凝膠的注射能力，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中都已經(jīng)分別測(cè)出。不同組織器官注射的注射器或?qū)Ч苡胁煌囊?guī)格，例如豬心肌衰弱制備的凝膠(6mg/ml)需要用27號(hào)導(dǎo)管注射。ECM水凝膠在注射過(guò)程中，室溫下注射能力可保持1小時(shí)，而相對(duì)于其它天然物質(zhì)如膠原蛋白和纖維蛋白具有明顯的優(yōu)勢(shì)[6]。

3 對(duì)ECM水凝膠的細(xì)胞反應(yīng)

ECM是細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，天然ECM的物理和力學(xué)性能都會(huì)影響細(xì)胞行為。機(jī)體重建ECM的過(guò)程中，還會(huì)生成多種細(xì)胞因子、趨化因子、活性肽等。在制備ECM水凝膠過(guò)程中保留的信號(hào)通路，會(huì)影響細(xì)胞發(fā)育、增殖、擴(kuò)散、形態(tài)、分化和表型，但其機(jī)制仍待研究。

在體外用ECM水凝膠培養(yǎng)各種細(xì)胞系和干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞都表現(xiàn)出了良好的發(fā)育能力。而使用溶解的ECM獲得的生物活性因子在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，雖然缺失水凝膠立體結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)細(xì)胞發(fā)育增殖仍有促進(jìn)作用。研究報(bào)道[7]，利用UBM和臍帶ECM水凝膠通過(guò)3種方法培養(yǎng)3T3成纖維細(xì)胞和C2C12肌細(xì)胞：①在凝膠表面培養(yǎng)；②包埋在凝膠中培養(yǎng)；③將凝膠置于體內(nèi)有缺陷的部位進(jìn)行培養(yǎng)。幾乎100%的3T3成纖維細(xì)胞和C2C12肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)7天時(shí)都存活了。C2C12肌細(xì)胞在臍帶ECM水凝膠表面培養(yǎng)時(shí)，分化成肌管呈放射狀排列的多核大細(xì)胞，而使用ECM包埋培養(yǎng)，UBM表面和內(nèi)部包埋培養(yǎng)，都發(fā)育成瘦長(zhǎng)的小細(xì)胞。而在嚙齒動(dòng)物有缺陷的腹壁植入的UBM水凝膠上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)了大量的新形成的肌肉，這個(gè)結(jié)果表明結(jié)合ECM水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物活性對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

4 ECM水凝膠的體內(nèi)應(yīng)用

基于ECM水凝膠的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，我們對(duì)水凝膠的應(yīng)用提出了一些構(gòu)想，雖然在體外結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系易于研究，但是在體內(nèi)應(yīng)用仍有許多未知方面，目前ECM水凝膠在缺陷部位的應(yīng)用有限，有在心和腦的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4.1 心

已有研究報(bào)道了心ECM水凝膠對(duì)缺血性損傷的心臟重建作用。異源ECM水凝膠用于心臟后形成了軟骨組織，意味著組織特異性對(duì)于心臟組織重建可能是必須因素。對(duì)不同心臟組織類(lèi)型在心臟的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)：①不同組織來(lái)源的影響-心包和心??；②種屬的影響-豬和人[8]。

豬心和人心都已經(jīng)應(yīng)用于臨床移植，相對(duì)于人心捐贈(zèng)者年齡、疾病等影響，豬心在飲食、年齡、品種等變量上更易控，但使用人ECM組織能降低異種疾病轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，盡管臨床上數(shù)百萬(wàn)接受豬ECM支架或豬器官組織移植的患者并沒(méi)有被報(bào)道過(guò)出現(xiàn)了動(dòng)物傳染病。在大鼠左心室心肌層注射了豬和人心ECM水凝膠，形成了相似的水凝膠的超微結(jié)構(gòu)。盡管如此，由于含有相同的DNA和脂質(zhì)，大部分人心預(yù)凝膠溶液并沒(méi)有凝膠化，故而需要更嚴(yán)格的去細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案，例如延長(zhǎng)SDS孵育時(shí)間、增加脂質(zhì)/DNA去除步驟，能夠增加ECM交聯(lián)度，而捐獻(xiàn)人年齡需控制在41～69歲。由于使用豬心ECM水凝膠，增加了組織應(yīng)用的有效性、使用了更溫和的去細(xì)胞方案、更高度的凝膠化，故而豬心在臨床應(yīng)用中更優(yōu)先，而人心ECM可作為體外研究心臟疾病的有效模型。

心包和心肌ECM水凝膠都被用于心肌衰弱修復(fù)的研究。心包膠原和彈性蛋白含量更高，應(yīng)用于自體修復(fù)的潛力更大，因?yàn)榍谐陌髮?duì)心臟功能沒(méi)有不利影響。心包ECM水凝膠(6.6mg/ml)和心肌ECM水凝膠(6mg/ml)注射到健康大鼠左心房，二者都支持細(xì)胞滲透(內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)，都在2周內(nèi)形成了小動(dòng)脈[9]?？傊陌麰CM水凝膠是一種理想的自體修復(fù)組織來(lái)源，心肌ECM水凝膠更多的是用于預(yù)臨床研究。

基于大鼠的轉(zhuǎn)錄組分析，初步研究了心衰ECM水凝膠治療調(diào)節(jié)血管重構(gòu)能力的分子機(jī)制，這是首個(gè)對(duì)ECM水凝膠治療調(diào)控全基因組表達(dá)的研究。相對(duì)于控鹽治療一周，ECM水凝膠治療有以下不同：改變了炎癥反應(yīng)；降低了心肌細(xì)胞的凋亡；改變了心衰的新陳代謝；促進(jìn)了祖細(xì)胞的定向移動(dòng)。促進(jìn)血管生成也是ECM水凝膠治療相較于其它體內(nèi)治療方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，可能是ECM水凝膠中含有的促學(xué)管生長(zhǎng)因子和活性蛋白促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的定向移動(dòng)，并為血管形成提供了支架。

4.2 腦

在使用同源ECM水凝膠用于研究心臟的應(yīng)用時(shí)，同時(shí)開(kāi)始研究使用異源ECM，尤其是UBM水凝膠治療中風(fēng)[10]和創(chuàng)傷性腦損傷[11]。在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型上，腦皮質(zhì)損傷一天后注射了UBM水凝膠(5mg/ml)，UBM緩和了組織損傷，表現(xiàn)在降低了機(jī)能障礙，降低了白質(zhì)損傷，在第21天提高了前庭小腦的功能。UBM水凝膠在組織復(fù)原方面顯示出了功能性的改善，這表明在腦的臨床應(yīng)用上可能需要水凝膠對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的募集，或者是水凝膠的其它性質(zhì)。

在輕度中風(fēng)的小動(dòng)物模型中，特定濃度的UBM水凝膠被用于免疫細(xì)胞滲透和物質(zhì)保留[12]。在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后14天注射了UBM水凝膠(1～8 mg/mL)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UBM水凝膠濃度<3 mg/mL時(shí)，在中風(fēng)障礙部位無(wú)法凝膠，在24小時(shí)內(nèi)水凝膠擴(kuò)散到了其它腦組織，并且細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入中風(fēng)部位，只是圍繞在其周?chē)?。?dāng)UBM水凝膠濃度>3 mg/mL時(shí)，在中風(fēng)部位順利凝膠，水凝膠只是擴(kuò)散到了與其它組織相連的接口處，注射一天后大量的細(xì)胞進(jìn)入到中風(fēng)部位，包括神經(jīng)祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞少突角質(zhì)細(xì)胞和星狀膠質(zhì)細(xì)胞。以上結(jié)果顯示UBM水凝膠在腦損傷的治療中，適合濃度為>3 mg/mL。

4.3 安全性

ECM水凝膠在體內(nèi)的任何臨床醫(yī)用上，安全性都是首要考慮的問(wèn)題。在上述心和腦的體內(nèi)臨床應(yīng)用中，ECM水凝膠被證實(shí)是安全的。在使用ECM水凝膠注射治療心梗三個(gè)月后，機(jī)體沒(méi)有發(fā)生心律失常、血栓和局部缺血[13]。體外生理實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ECM水凝膠具有血液相容性，不會(huì)加快血液凝固。

經(jīng)檢測(cè)，將UBM水凝膠(5mg/ml)直接注射到正常大腦后，沒(méi)有毒性影響，也沒(méi)有星狀細(xì)胞增多反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞在注射后1、3、7天沒(méi)有發(fā)生退化。心臟注射ECM水凝膠2小時(shí)后，沒(méi)有在肺、肝、脾、腎、腦等組織中發(fā)現(xiàn)水凝膠[14]。

4.4 體內(nèi)應(yīng)用總結(jié)

心、腦是在臨床中僅需要最低限度刺激的兩個(gè)器官，因此被選作ECM水凝膠注射治療的目標(biāo)。無(wú)論是在大動(dòng)物、還是小動(dòng)物的心臟治療中，ECM水凝膠注射療法都表現(xiàn)出安全性和高效性，也已經(jīng)進(jìn)入臨床治療評(píng)估階段Ⅰ。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)ECM水凝膠注射療法中，ECM的濃度會(huì)有很大的影響，今后的研究方向很可能是改進(jìn)方法過(guò)程中各種因素的平衡?？傊魏我粋€(gè)新的治療方法都需要完全掌握臨床移植應(yīng)用中ECM水凝膠結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系。

5 應(yīng)用前景

在過(guò)去幾十年間，盡管有數(shù)百篇文獻(xiàn)綜述ECM水凝膠的治療潛力，但對(duì)ECM水凝膠在體外的結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系和其它體內(nèi)臨床應(yīng)用可能仍然未知。ECM水凝膠調(diào)控細(xì)胞行為的機(jī)制也仍待研究，可能和水凝膠的空隙和纖維直徑適合內(nèi)源細(xì)胞滲透、保留大量生長(zhǎng)因子和活性肽有關(guān)。近期研究提出一種新的可能機(jī)制，在ECM水凝膠生物支架中存在具有生物活性、矩陣排列的納米囊泡[15]?？傊窈髮?duì)于ECM水凝膠對(duì)組織重構(gòu)的研究偏向治療機(jī)制，因?yàn)槠湓谂R床治療方面有著巨大的應(yīng)用前景。