• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    cetuximab聯(lián)合5-FU對(duì)直腸癌放射治療敏感度影響的實(shí)驗(yàn)研究

    2019-03-05 07:58:38左志貴王蓉蓉葉星照史壹雄姜有恒宋華羽倪士昌
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:西妥氟尿嘧啶抑制率

    左志貴 王蓉蓉 葉星照 史壹雄 姜有恒 宋華羽 倪士昌 蔣 磊

    行新輔助放療后再接受手術(shù)是目前局部進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略,但是臨床實(shí)踐中直腸癌單純放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)效果并不理想,對(duì)放療有明顯效果、部分效果和效果不明顯的患者各占約1/ 3左右[1]。對(duì)于沒有明顯效果的患者采用術(shù)前放療則可能導(dǎo)致疾病在治療過(guò)程中進(jìn)展,從而延誤患者手術(shù)治療,將化療與放療聯(lián)合提高了直腸癌術(shù)前單純放療的效果,目前局部進(jìn)展期直腸癌新輔助治療推薦放療與希羅達(dá)聯(lián)合進(jìn)行,但效果仍然不很理想,如何進(jìn)一步提高局部進(jìn)展期直腸新輔助治療的效果一直是結(jié)直腸癌領(lǐng)域基礎(chǔ)及臨床研究的熱點(diǎn)[2,3]。筆者前期研究及國(guó)內(nèi)外其他研究顯示EGFR通路在放療抵抗中發(fā)揮重要作用[4]。那么通過(guò)阻斷EGFR通路可以預(yù)期在既往基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高術(shù)前放化療效果,目前臨床廣泛使用的EGFR通路阻斷劑是西妥昔單抗,本研究旨在通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確EGFR通路阻斷劑西妥昔單抗是否可以在同步化療基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的治療效果。

    材料與方法

    1.實(shí)驗(yàn)材料:結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO為溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代獲取,前期已經(jīng)篩選用于實(shí)驗(yàn)的RKO細(xì)胞滿足3個(gè)條件:①EGFR中高表達(dá);②K-ras基因?yàn)橐吧?③PIK3CA基因?yàn)橥蛔冃?。本?shí)驗(yàn)所需4~6周齡BALB/CA裸鼠(SPF級(jí),雌性)均購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(瀘)2013-0056;DMEM完全培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo生物公司;CKK-8試劑盒,購(gòu)自碧云天公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司,細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒PI/RNase Staining Buffer(細(xì)胞周期檢測(cè))購(gòu)自BD Pharmingen公司。

    2.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:采用DMEM完全培養(yǎng)液(含15%胎牛血清),加入100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素培養(yǎng)RKO細(xì)胞,每48h傳代1次,培養(yǎng)條件:5%CO2、37℃。無(wú)菌操作,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    3.CKK-8法檢測(cè)氟尿嘧啶給藥劑量(IC50):在DMEM培養(yǎng)基中分別加入氟尿嘧啶干預(yù)的濃度梯度為0、5、10、25、50、100μg/ml,藥物干預(yù)48h后對(duì)各個(gè)濃度梯度行CCK8檢測(cè)計(jì)算各個(gè)濃度梯度細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。將各個(gè)濃度與濃度相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率一起通過(guò)SPSS軟件繪制氟尿嘧啶濃度生長(zhǎng)抑制曲線,取氟尿嘧啶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為30%~40%作為該實(shí)驗(yàn)氟尿嘧啶干預(yù)的實(shí)驗(yàn)濃度。最終本研究選取的氟尿嘧啶工作濃度為2.5μg/ml,西妥昔單抗采用文獻(xiàn)普遍采用的濃度100μg/ml。

    4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成瘤裸鼠氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥劑量的計(jì)算:據(jù)氟尿嘧啶及西妥昔單抗在人體結(jié)直腸癌治療中的給藥劑量,同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)給定的不同種屬動(dòng)物和人有效劑量變異計(jì)算每只裸鼠的給藥劑量。4~6周齡裸鼠體重平均20mg,體表面積平均0.008m2。最終氟尿嘧啶給藥劑量換算為每周氟尿嘧啶給藥總量0.36ml,分兩次給予,每次給予0.18ml,西妥昔單抗每周給藥總量0.4ml,分兩次給予,每次0.2ml。

    5.CKK-8法檢測(cè)不同干預(yù)方式對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率:RKO細(xì)胞系藥物分4個(gè)時(shí)段分別給予2Gy放療,2Gy放療聯(lián)合氟尿嘧啶給藥,2Gy放療聯(lián)合西妥昔單抗給藥,2Gy放療聯(lián)合氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥,同時(shí)設(shè)不干預(yù)對(duì)照組。分別在培養(yǎng)24、48、72、96h進(jìn)行 CCK-8檢測(cè),生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組A平均值-實(shí)驗(yàn)組A平均值)/對(duì)照組A平均值×100%。

    6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響:取6孔板2Gy照射后12h分別給予2.5μg/ml濃度氟尿嘧啶處理、西妥昔單抗100μg/ml濃度處理、氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗處理,各處理后細(xì)胞系移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育48h,隨后離心收集各組細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

    7.細(xì)胞周期檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響:采用以上相同處理方法處理后細(xì)胞系移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育48h,離心收集各組細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(MACSQuantTMAnalyzer, Miltenyi Biotec),一般計(jì)數(shù)2萬(wàn)~3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件MACSQuantifyTMversion 2.1分析。

    8.裸鼠成瘤模型建立及不同干預(yù)的腫瘤抑制情況:取6周雌性裸鼠36只,體重、體積實(shí)驗(yàn)前大致相同,每只裸鼠右前肢腋部皮下分別緩慢注射1×107/ml RKO細(xì)胞,當(dāng)裸鼠皮下開始緩慢出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié),以皮下結(jié)節(jié)直徑達(dá)到0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)皮下腫瘤體積增大到60~80cm3時(shí)將成瘤成功的30只裸鼠隨機(jī)分成5組,每組6只。裸鼠給藥方式為瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射藥物,給藥后每周觀察各實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)情況,用直尺測(cè)量和計(jì)算腫瘤體積,具體測(cè)量數(shù)據(jù)為腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),按下列公式計(jì)算體積:V(mm3)=(a×b2)/2,按照計(jì)算數(shù)據(jù)描繪各組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。注射干預(yù)6周后用脫頸椎發(fā)處死裸鼠,剝下腫瘤,稱重。腫瘤的抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均體積-給藥組平均體積)/對(duì)照組平均體積×100%。

    結(jié) 果

    1.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較:CCK8檢測(cè)繪制不同干預(yù)方式處理后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖1)。氟尿嘧啶和西妥昔單抗均能提高放療線對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,但氟尿嘧啶的作用更明顯,氟尿嘧啶與西妥昔單抗同時(shí)與放療聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與氟尿嘧啶單獨(dú)與放療聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用相當(dāng)。

    圖1 不同干預(yù)方式腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

    對(duì)不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示氟尿嘧啶組及西妥昔單抗各自單獨(dú)聯(lián)合放療均明顯提高了放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗與各自單用相比對(duì)提高放療的效果不明顯,抑制率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

    表1 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較

    3組之間行方差分析,F(xiàn)=25.12,P=0.001;兩組之間SNK檢驗(yàn),P=0.15、0.19、0.23;P值均為與放射總量2Gy放療組比較

    2.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率的比較:對(duì)給予不同干預(yù)方式處理48h后的RKO細(xì)胞系進(jìn)行凋亡檢測(cè)。流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示西妥昔單抗及氟尿嘧啶各自與2Gy放療聯(lián)合均明顯提高了2Gy單獨(dú)放療的凋亡率,氟尿嘧啶與2Gy聯(lián)合提高2Gy單獨(dú)放療凋亡率更加明顯,西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy單獨(dú)放療的凋亡率并不比氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy單獨(dú)放療的凋亡率更明顯(圖2,表2)。

    圖2 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率的比較

    表2 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞總凋亡率比較

    3.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤周期影響的比較:給予不同干預(yù)方式處理48h后RKO細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞周期分布檢測(cè),研究不同干預(yù)方式對(duì)放療引起G1/G0停頓的影響(圖3)。

    圖3 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞周期分布的比較

    西妥昔單抗與2Gy放療聯(lián)合明顯降低了G1/G0期腫瘤細(xì)胞比例(P<0.05),而氟尿嘧啶與2Gy放療聯(lián)合則導(dǎo)致細(xì)胞周期檢測(cè)出現(xiàn)一個(gè)明顯凋亡峰,顯示西妥昔單抗提高放療敏感度主要通過(guò)改變細(xì)胞周期,減少引起對(duì)放療損傷逃逸的G1/G0期細(xì)胞的比例,氟尿嘧啶提高放療敏感度主要通過(guò)增加細(xì)胞凋亡發(fā)生作用(表3)。

    表3 西妥昔單抗聯(lián)合放療對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

    4.不同干預(yù)處理對(duì)裸鼠移植瘤重量影響的比較:各組裸鼠成瘤給予不同干預(yù)6周后采用脫頸法處死裸鼠,解剖游離瘤體后電子秤給予稱重,解剖過(guò)程中注意不要將瘤體中摻雜正常組織。各組移植瘤解剖稱重后計(jì)算各組移植瘤重量平均值,同時(shí)通過(guò)與對(duì)照組平均值比較計(jì)算不同干預(yù)措施對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及各組抑瘤率(表4)。

    表4 不同干預(yù)組瘤體重量比較

    結(jié)果顯示2Gy+氟尿嘧啶組,2Gy+西妥昔單抗組,2Gy+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組各組瘤體重量均明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而2Gy照射組雖瘤體重量低于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表5 氟尿嘧啶聯(lián)合放療組與單純放療組瘤體重量比較

    研究顯示氟尿嘧啶明顯增加了2Gy放療對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用(P<0.05,表5)。西妥昔單抗則沒有明顯增加了2Gy放療對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用(P>0.05,表6)。

    表6 西妥昔單抗聯(lián)合放療組與單純放療組瘤體重量比較

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),兩藥聯(lián)合放療組與氟尿嘧啶單藥聯(lián)合放療組瘤體重量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表7),說(shuō)明西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合并沒有明顯提高氟尿嘧啶單藥與放療聯(lián)合的作用。總體說(shuō)明西妥昔單抗無(wú)論是單藥還是聯(lián)合對(duì)放療敏感度的增加均不明顯。

    表7 兩藥同時(shí)聯(lián)合放組與氟尿嘧啶聯(lián)合放療組瘤體重量比較

    討 論

    放射生物學(xué)研究顯示EGFR通路在放射治療過(guò)程中腫瘤內(nèi)分子生物學(xué)動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮重要作用,參與了放療抵抗,因此當(dāng)EGFR拮抗劑西妥昔單抗應(yīng)用于臨床時(shí)西妥昔單抗開始與放療聯(lián)合治療頭頸部鱗癌,顯示出一定的治療效果[5]。Nasu等[6]研究顯示,C225與放療聯(lián)合可以增加肺癌移植瘤A431的放療效果,Liu等[7]研究也顯示C225與放療聯(lián)合可以增加前列腺癌細(xì)胞的放療敏感度,而Shin等[8]進(jìn)行的體外研究則顯示西妥昔單抗與放療聯(lián)合可以增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系的放療敏感度,因此西妥昔單抗與放療聯(lián)合顯示了較好的應(yīng)用前景。

    由于氟尿嘧啶與放療聯(lián)合在直腸癌術(shù)前放療中的價(jià)值已經(jīng)得到肯定并在臨床中廣泛應(yīng)用,那么將西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合,如果能進(jìn)一步提高直腸癌術(shù)前放射治療的效果將具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值,而目前尚無(wú)西妥昔單抗聯(lián)合氟尿嘧啶增加放療效果的基礎(chǔ)研究報(bào)道,筆者希望通過(guò)基礎(chǔ)研究明確西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合在直腸癌新輔助治療中的價(jià)值。

    本研究從細(xì)胞和動(dòng)物水平研究氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌放療敏感度的影響,結(jié)果顯示氟尿嘧啶、西妥昔單抗各自單藥以及兩藥聯(lián)合均可以明顯增加2Gy照射對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖以及裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),氟尿嘧啶聯(lián)合2Gy照射的抑制作用較西妥昔單抗聯(lián)合的抑制作用更強(qiáng),而且氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗后與單用氟尿嘧啶相比并未明顯增加2Gy照射對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用(P>0.05)。

    本研究顯示氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯(lián)合使用并沒有發(fā)揮疊加或協(xié)同作用,西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合并沒有提高放療的效果。但本研究是細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),存在明顯的局限性,目前也有一些臨床研究探討了西妥昔單抗用于放療增敏的問(wèn)題,Weiss等[9]研究顯示,將西妥昔單抗與卡培他濱及奧沙利鉑聯(lián)合并沒有進(jìn)一步提高卡培他濱與奧沙利鉑聯(lián)合放療的效果,考慮到西妥昔單抗臨床治療效果與K-ras突變有關(guān),因此Grimminge等[10]研究局部進(jìn)展期患者中基因表達(dá)與西妥昔單抗聯(lián)合化療提高局部進(jìn)展期術(shù)前放療效果的關(guān)系,結(jié)果顯示治療前EGFR、VEGFR在mRNA水平的表達(dá)以及K-ras突變是西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏效果的有效分子標(biāo)志物。

    綜上所述,總體上西妥昔單抗與化療藥聯(lián)合并沒有提高放療的效果,西妥昔單抗的臨床應(yīng)用無(wú)法改變目前氟尿嘧啶與術(shù)前放療聯(lián)合在中低位直腸癌新輔助治療中的主導(dǎo)地位,但考慮到腫瘤的異質(zhì)性,未來(lái)尋找對(duì)西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏效果的有效分子標(biāo)志物將是重要的研究方向。

    猜你喜歡
    西妥氟尿嘧啶抑制率
    中藥單體對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    氟尿嘧啶聯(lián)合白介素II局封治療多發(fā)性跖疣療效觀察
    血栓彈力圖評(píng)估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    西妥昔單抗在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌一線治療后的后續(xù)應(yīng)用研究進(jìn)展
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    用氟尿嘧啶注射液聯(lián)合薔薇紅核植物抑菌液治療跖疣的療效觀察
    血紅素加氧酶-1的表達(dá)對(duì)氟尿嘧啶誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的影響
    EGFR表達(dá)與放療抵抗的關(guān)系及西妥昔單抗用于直腸癌術(shù)前放療增敏的研究進(jìn)展
    西妥昔單抗聯(lián)合IMRT同步化療治療晚期鼻咽癌的療效觀察
    仙茅多糖對(duì)氟尿嘧啶增效減毒作用
    久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久精品大字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美成人a在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 男女床上黄色一级片免费看| 宅男免费午夜| 色吧在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 美女黄网站色视频| 一进一出好大好爽视频| 少妇丰满av| 精品国产三级普通话版| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品人妻1区二区| 男人舔奶头视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产高清视频在线播放一区| 两个人的视频大全免费| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久久电影 | 国内精品美女久久久久久| 九九在线视频观看精品| 女同久久另类99精品国产91| 在线天堂最新版资源| 三级国产精品欧美在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 动漫黄色视频在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 色在线成人网| 在线观看一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 国产精品一及| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美一区二区亚洲| 我要搜黄色片| 嫩草影院精品99| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 最后的刺客免费高清国语| 69人妻影院| 制服丝袜大香蕉在线| 日本免费a在线| 色播亚洲综合网| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久亚洲真实| 欧美成人a在线观看| 午夜免费激情av| 一级作爱视频免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 欧美色欧美亚洲另类二区| 婷婷丁香在线五月| 欧美大码av| 国产精品电影一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲最大成人中文| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美区成人在线视频| 久久久久久九九精品二区国产| 最好的美女福利视频网| 五月伊人婷婷丁香| 精品国产三级普通话版| 97超视频在线观看视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 搡老妇女老女人老熟妇| 夜夜爽天天搞| 国产精华一区二区三区| 久99久视频精品免费| e午夜精品久久久久久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产av一区在线观看免费| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲国产欧美网| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 悠悠久久av| 久久久久亚洲av毛片大全| 无遮挡黄片免费观看| av国产免费在线观看| 国产精品一及| 淫秽高清视频在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩高清综合在线| 国产淫片久久久久久久久 | 久久99热这里只有精品18| 99在线人妻在线中文字幕| 日本免费a在线| 99riav亚洲国产免费| 好男人在线观看高清免费视频| 午夜激情欧美在线| 国产精品永久免费网站| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩欧美在线乱码| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费观看精品视频网站| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲最大成人中文| 欧美区成人在线视频| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 乱人视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜精品久久久久久毛片777| 99精品久久久久人妻精品| 国产成人av教育| 亚洲avbb在线观看| 午夜久久久久精精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产成+人综合+亚洲专区| av福利片在线观看| 午夜福利高清视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久99热这里只有精品18| 成年女人永久免费观看视频| 天美传媒精品一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲无线观看免费| 波野结衣二区三区在线 | 一二三四社区在线视频社区8| 日本免费a在线| 国产成人影院久久av| 少妇人妻精品综合一区二区 | www日本黄色视频网| 一二三四社区在线视频社区8| 日本a在线网址| 毛片女人毛片| 女人被狂操c到高潮| 亚洲在线自拍视频| 国产精品亚洲美女久久久| 波野结衣二区三区在线 | 免费在线观看成人毛片| 午夜福利成人在线免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 窝窝影院91人妻| netflix在线观看网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 波野结衣二区三区在线 | 亚洲专区中文字幕在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲内射少妇av| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美成人a在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 国产极品精品免费视频能看的| 无遮挡黄片免费观看| 婷婷六月久久综合丁香| 香蕉av资源在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品女同一区二区软件 | 免费在线观看亚洲国产| 99久久综合精品五月天人人| 日韩欧美国产在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国语自产精品视频在线第100页| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品国产三级普通话版| 色吧在线观看| 舔av片在线| 一区二区三区免费毛片| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本三级黄在线观看| 中文字幕久久专区| 国产探花极品一区二区| 国产99白浆流出| 亚洲国产精品999在线| 国产91精品成人一区二区三区| 岛国视频午夜一区免费看| 俄罗斯特黄特色一大片| 母亲3免费完整高清在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 女人被狂操c到高潮| 国产高清videossex| 麻豆一二三区av精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99久久九九国产精品国产免费| 国产乱人视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲精华国产精华精| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产在线精品亚洲第一网站| av福利片在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 久久性视频一级片| 欧美中文综合在线视频| 无限看片的www在线观看| 悠悠久久av| 男女床上黄色一级片免费看| 日韩高清综合在线| 欧美一级毛片孕妇| 午夜日韩欧美国产| 国产爱豆传媒在线观看| 免费高清视频大片| 禁无遮挡网站| 久久伊人香网站| 亚洲欧美日韩东京热| 日本与韩国留学比较| 淫秽高清视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 一本精品99久久精品77| www日本在线高清视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 麻豆国产97在线/欧美| 中国美女看黄片| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| e午夜精品久久久久久久| 午夜视频国产福利| 动漫黄色视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美性感艳星| 51国产日韩欧美| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利高清视频| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲成av人片免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久国产精品影院| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久久久久精品吃奶| 美女高潮的动态| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美bdsm另类| 色精品久久人妻99蜜桃| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩精品中文字幕看吧| 在线观看一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲五月婷婷丁香| 九色国产91popny在线| 色哟哟哟哟哟哟| 国产高清视频在线观看网站| 在线观看日韩欧美| 搡老熟女国产l中国老女人| 少妇人妻一区二区三区视频| 成人午夜高清在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| av欧美777| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中出人妻视频一区二区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美大码av| 欧美三级亚洲精品| 宅男免费午夜| 男人和女人高潮做爰伦理| 一级毛片女人18水好多| av在线蜜桃| 亚洲熟妇熟女久久| 熟女人妻精品中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩免费av在线播放| 亚洲内射少妇av| 最近在线观看免费完整版| 国产色婷婷99| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲内射少妇av| 男人和女人高潮做爰伦理| 国内精品久久久久精免费| 欧美三级亚洲精品| 九色成人免费人妻av| 久99久视频精品免费| 99久久精品一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品三级大全| 在线观看免费午夜福利视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产视频内射| www日本在线高清视频| 午夜a级毛片| 嫩草影院入口| 男女那种视频在线观看| 身体一侧抽搐| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人av激情在线播放| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 日本一本二区三区精品| 精品一区二区三区人妻视频| 成年女人永久免费观看视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品亚洲美女久久久| 一级a爱片免费观看的视频| 性色av乱码一区二区三区2| 老司机福利观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久久久久久久黄片| 欧美色视频一区免费| 一区二区三区国产精品乱码| 免费看a级黄色片| 叶爱在线成人免费视频播放| 又爽又黄无遮挡网站| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一二三四社区在线视频社区8| 色视频www国产| 少妇熟女aⅴ在线视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | or卡值多少钱| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| www.色视频.com| 欧美乱妇无乱码| 中文字幕av在线有码专区| 精品久久久久久,| 免费看十八禁软件| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 国产久久久一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品影院6| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲色图av天堂| 黄片小视频在线播放| 在线观看免费午夜福利视频| 一本综合久久免费| 国产一区在线观看成人免费| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 色在线成人网| 在线观看午夜福利视频| 中文字幕久久专区| 美女大奶头视频| 成人无遮挡网站| 免费在线观看日本一区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩欧美精品v在线| 久久九九热精品免费| 韩国av一区二区三区四区| 久久亚洲精品不卡| 最近在线观看免费完整版| 特级一级黄色大片| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美3d第一页| 日本黄大片高清| 两个人视频免费观看高清| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 好男人电影高清在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲人成网站高清观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 最近最新免费中文字幕在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 在线观看一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 国产探花极品一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 久久久国产成人精品二区| 亚洲中文字幕日韩| 听说在线观看完整版免费高清| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 在线观看舔阴道视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 丁香六月欧美| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 99在线视频只有这里精品首页| www日本在线高清视频| 少妇的逼好多水| 精品日产1卡2卡| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人欧美大片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 一级黄片播放器| 女同久久另类99精品国产91| 欧美一区二区亚洲| 日本一本二区三区精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲18禁久久av| 国产v大片淫在线免费观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久99热这里只有精品18| 国产日本99.免费观看| 国产精品久久久久久久电影 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 九色成人免费人妻av| 欧美中文综合在线视频| 嫩草影视91久久| 国产成人影院久久av| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费电影在线观看免费观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产视频一区二区在线看| 我要搜黄色片| 怎么达到女性高潮| 最新中文字幕久久久久| 午夜激情欧美在线| 熟女电影av网| 亚洲av熟女| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 久久精品人妻少妇| 日韩高清综合在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99在线人妻在线中文字幕| 久久伊人香网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美乱妇无乱码| 成年版毛片免费区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产成人欧美在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美黑人巨大hd| 欧美+日韩+精品| 丰满乱子伦码专区| 最近最新中文字幕大全电影3| 色在线成人网| 一进一出抽搐动态| 精品福利观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 97超视频在线观看视频| 欧美在线黄色| 中国美女看黄片| 少妇高潮的动态图| 极品教师在线免费播放| 天堂网av新在线| 亚洲美女视频黄频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一进一出抽搐gif免费好疼| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 少妇高潮的动态图| 18禁在线播放成人免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品国产三级普通话版| 桃色一区二区三区在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 一本一本综合久久| 波野结衣二区三区在线 | 亚洲精品456在线播放app | 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩欧美 国产精品| 午夜老司机福利剧场| 国产精品国产高清国产av| 亚洲无线在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产精品久久久久久久久免 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 天天添夜夜摸| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av美国av| 亚洲第一电影网av| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费在线观看成人毛片| 亚洲成人久久性| 亚洲成av人片免费观看| 在线天堂最新版资源| 99久久无色码亚洲精品果冻| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 色综合站精品国产| 久久久精品大字幕| 国产欧美日韩一区二区三| 女人被狂操c到高潮| 嫩草影视91久久| 一级作爱视频免费观看| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品久久国产高清桃花| 757午夜福利合集在线观看| 18禁在线播放成人免费| 免费在线观看日本一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 精华霜和精华液先用哪个| 免费在线观看成人毛片| 久久久久久人人人人人| 日韩亚洲欧美综合| 午夜两性在线视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲欧美日韩东京热| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 老司机午夜十八禁免费视频| 91久久精品电影网| 好男人在线观看高清免费视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲精华国产精华精| 岛国在线观看网站| 亚洲七黄色美女视频| 国产免费男女视频| 观看美女的网站| 中文资源天堂在线| 女同久久另类99精品国产91| 91久久精品国产一区二区成人 | eeuss影院久久| 99久久综合精品五月天人人| 久久精品国产自在天天线| 欧美一级毛片孕妇| 美女大奶头视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一二三四社区在线视频社区8| 两个人看的免费小视频| 国产精品久久久久久精品电影| 制服人妻中文乱码| 88av欧美| 真实男女啪啪啪动态图| 免费电影在线观看免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 日本一本二区三区精品| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品一区二区免费欧美| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲人成网站高清观看| 日韩欧美三级三区| 国产成人a区在线观看| 丰满的人妻完整版| 久久人妻av系列| 美女黄网站色视频| 天堂网av新在线| 岛国视频午夜一区免费看| 观看免费一级毛片| 免费高清视频大片| 天堂网av新在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 麻豆国产97在线/欧美| 最新美女视频免费是黄的| 男女午夜视频在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人国产一区最新在线观看| 欧美激情在线99| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 国内精品一区二区在线观看| 欧美zozozo另类| 免费av不卡在线播放| 日韩高清综合在线| 日本黄色视频三级网站网址| 1024手机看黄色片| 免费在线观看影片大全网站| 欧美日韩一级在线毛片| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人av教育| 久久人人精品亚洲av| 夜夜夜夜夜久久久久| 少妇丰满av| 日本在线视频免费播放| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人一区二区视频在线观看| 露出奶头的视频| 亚洲午夜理论影院| 成人午夜高清在线视频| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜老司机福利剧场| 两个人的视频大全免费| 女警被强在线播放| 最好的美女福利视频网| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品av视频在线免费观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产欧美日韩精品一区二区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜福利在线观看吧| 国内精品美女久久久久久| 在线观看免费午夜福利视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲人与动物交配视频| 日韩欧美精品v在线| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美三级三区| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费观看人在逋| 婷婷精品国产亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品无人区乱码1区二区| 美女大奶头视频|