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    cetuximab聯(lián)合5-FU對(duì)直腸癌放射治療敏感度影響的實(shí)驗(yàn)研究

    2019-03-05 07:58:38左志貴王蓉蓉葉星照史壹雄姜有恒宋華羽倪士昌
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2019年2期
    關(guān)鍵詞:西妥氟尿嘧啶抑制率

    左志貴 王蓉蓉 葉星照 史壹雄 姜有恒 宋華羽 倪士昌 蔣 磊

    行新輔助放療后再接受手術(shù)是目前局部進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療策略,但是臨床實(shí)踐中直腸癌單純放射治療(以下簡(jiǎn)稱放療)效果并不理想,對(duì)放療有明顯效果、部分效果和效果不明顯的患者各占約1/ 3左右[1]。對(duì)于沒有明顯效果的患者采用術(shù)前放療則可能導(dǎo)致疾病在治療過(guò)程中進(jìn)展,從而延誤患者手術(shù)治療,將化療與放療聯(lián)合提高了直腸癌術(shù)前單純放療的效果,目前局部進(jìn)展期直腸癌新輔助治療推薦放療與希羅達(dá)聯(lián)合進(jìn)行,但效果仍然不很理想,如何進(jìn)一步提高局部進(jìn)展期直腸新輔助治療的效果一直是結(jié)直腸癌領(lǐng)域基礎(chǔ)及臨床研究的熱點(diǎn)[2,3]。筆者前期研究及國(guó)內(nèi)外其他研究顯示EGFR通路在放療抵抗中發(fā)揮重要作用[4]。那么通過(guò)阻斷EGFR通路可以預(yù)期在既往基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高術(shù)前放化療效果,目前臨床廣泛使用的EGFR通路阻斷劑是西妥昔單抗,本研究旨在通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確EGFR通路阻斷劑西妥昔單抗是否可以在同步化療基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高放療對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的治療效果。

    材料與方法

    1.實(shí)驗(yàn)材料:結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO為溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代獲取,前期已經(jīng)篩選用于實(shí)驗(yàn)的RKO細(xì)胞滿足3個(gè)條件:①EGFR中高表達(dá);②K-ras基因?yàn)橐吧?③PIK3CA基因?yàn)橥蛔冃?。本?shí)驗(yàn)所需4~6周齡BALB/CA裸鼠(SPF級(jí),雌性)均購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SYXK(瀘)2013-0056;DMEM完全培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo生物公司;CKK-8試劑盒,購(gòu)自碧云天公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司,細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒PI/RNase Staining Buffer(細(xì)胞周期檢測(cè))購(gòu)自BD Pharmingen公司。

    2.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:采用DMEM完全培養(yǎng)液(含15%胎牛血清),加入100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素培養(yǎng)RKO細(xì)胞,每48h傳代1次,培養(yǎng)條件:5%CO2、37℃。無(wú)菌操作,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    3.CKK-8法檢測(cè)氟尿嘧啶給藥劑量(IC50):在DMEM培養(yǎng)基中分別加入氟尿嘧啶干預(yù)的濃度梯度為0、5、10、25、50、100μg/ml,藥物干預(yù)48h后對(duì)各個(gè)濃度梯度行CCK8檢測(cè)計(jì)算各個(gè)濃度梯度細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。將各個(gè)濃度與濃度相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率一起通過(guò)SPSS軟件繪制氟尿嘧啶濃度生長(zhǎng)抑制曲線,取氟尿嘧啶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為30%~40%作為該實(shí)驗(yàn)氟尿嘧啶干預(yù)的實(shí)驗(yàn)濃度。最終本研究選取的氟尿嘧啶工作濃度為2.5μg/ml,西妥昔單抗采用文獻(xiàn)普遍采用的濃度100μg/ml。

    4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成瘤裸鼠氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥劑量的計(jì)算:據(jù)氟尿嘧啶及西妥昔單抗在人體結(jié)直腸癌治療中的給藥劑量,同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)給定的不同種屬動(dòng)物和人有效劑量變異計(jì)算每只裸鼠的給藥劑量。4~6周齡裸鼠體重平均20mg,體表面積平均0.008m2。最終氟尿嘧啶給藥劑量換算為每周氟尿嘧啶給藥總量0.36ml,分兩次給予,每次給予0.18ml,西妥昔單抗每周給藥總量0.4ml,分兩次給予,每次0.2ml。

    5.CKK-8法檢測(cè)不同干預(yù)方式對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率:RKO細(xì)胞系藥物分4個(gè)時(shí)段分別給予2Gy放療,2Gy放療聯(lián)合氟尿嘧啶給藥,2Gy放療聯(lián)合西妥昔單抗給藥,2Gy放療聯(lián)合氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥,同時(shí)設(shè)不干預(yù)對(duì)照組。分別在培養(yǎng)24、48、72、96h進(jìn)行 CCK-8檢測(cè),生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組A平均值-實(shí)驗(yàn)組A平均值)/對(duì)照組A平均值×100%。

    6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響:取6孔板2Gy照射后12h分別給予2.5μg/ml濃度氟尿嘧啶處理、西妥昔單抗100μg/ml濃度處理、氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗處理,各處理后細(xì)胞系移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育48h,隨后離心收集各組細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

    7.細(xì)胞周期檢測(cè)不同干預(yù)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響:采用以上相同處理方法處理后細(xì)胞系移入37℃孵箱中繼續(xù)孵育48h,離心收集各組細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(MACSQuantTMAnalyzer, Miltenyi Biotec),一般計(jì)數(shù)2萬(wàn)~3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件MACSQuantifyTMversion 2.1分析。

    8.裸鼠成瘤模型建立及不同干預(yù)的腫瘤抑制情況:取6周雌性裸鼠36只,體重、體積實(shí)驗(yàn)前大致相同,每只裸鼠右前肢腋部皮下分別緩慢注射1×107/ml RKO細(xì)胞,當(dāng)裸鼠皮下開始緩慢出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié),以皮下結(jié)節(jié)直徑達(dá)到0.5cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)皮下腫瘤體積增大到60~80cm3時(shí)將成瘤成功的30只裸鼠隨機(jī)分成5組,每組6只。裸鼠給藥方式為瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射藥物,給藥后每周觀察各實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)情況,用直尺測(cè)量和計(jì)算腫瘤體積,具體測(cè)量數(shù)據(jù)為腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b),按下列公式計(jì)算體積:V(mm3)=(a×b2)/2,按照計(jì)算數(shù)據(jù)描繪各組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線。注射干預(yù)6周后用脫頸椎發(fā)處死裸鼠,剝下腫瘤,稱重。腫瘤的抑瘤率(%)=(對(duì)照組平均體積-給藥組平均體積)/對(duì)照組平均體積×100%。

    結(jié) 果

    1.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的比較:CCK8檢測(cè)繪制不同干預(yù)方式處理后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖1)。氟尿嘧啶和西妥昔單抗均能提高放療線對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用,但氟尿嘧啶的作用更明顯,氟尿嘧啶與西妥昔單抗同時(shí)與放療聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與氟尿嘧啶單獨(dú)與放療聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用相當(dāng)。

    圖1 不同干預(yù)方式腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較

    對(duì)不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示氟尿嘧啶組及西妥昔單抗各自單獨(dú)聯(lián)合放療均明顯提高了放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗與各自單用相比對(duì)提高放療的效果不明顯,抑制率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

    表1 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較

    3組之間行方差分析,F(xiàn)=25.12,P=0.001;兩組之間SNK檢驗(yàn),P=0.15、0.19、0.23;P值均為與放射總量2Gy放療組比較

    2.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率的比較:對(duì)給予不同干預(yù)方式處理48h后的RKO細(xì)胞系進(jìn)行凋亡檢測(cè)。流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示西妥昔單抗及氟尿嘧啶各自與2Gy放療聯(lián)合均明顯提高了2Gy單獨(dú)放療的凋亡率,氟尿嘧啶與2Gy聯(lián)合提高2Gy單獨(dú)放療凋亡率更加明顯,西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy單獨(dú)放療的凋亡率并不比氟尿嘧啶聯(lián)合對(duì)提高2Gy單獨(dú)放療的凋亡率更明顯(圖2,表2)。

    圖2 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生率的比較

    表2 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞總凋亡率比較

    3.不同干預(yù)處理對(duì)腫瘤周期影響的比較:給予不同干預(yù)方式處理48h后RKO細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞周期分布檢測(cè),研究不同干預(yù)方式對(duì)放療引起G1/G0停頓的影響(圖3)。

    圖3 不同干預(yù)方式處理48h后腫瘤細(xì)胞周期分布的比較

    西妥昔單抗與2Gy放療聯(lián)合明顯降低了G1/G0期腫瘤細(xì)胞比例(P<0.05),而氟尿嘧啶與2Gy放療聯(lián)合則導(dǎo)致細(xì)胞周期檢測(cè)出現(xiàn)一個(gè)明顯凋亡峰,顯示西妥昔單抗提高放療敏感度主要通過(guò)改變細(xì)胞周期,減少引起對(duì)放療損傷逃逸的G1/G0期細(xì)胞的比例,氟尿嘧啶提高放療敏感度主要通過(guò)增加細(xì)胞凋亡發(fā)生作用(表3)。

    表3 西妥昔單抗聯(lián)合放療對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

    4.不同干預(yù)處理對(duì)裸鼠移植瘤重量影響的比較:各組裸鼠成瘤給予不同干預(yù)6周后采用脫頸法處死裸鼠,解剖游離瘤體后電子秤給予稱重,解剖過(guò)程中注意不要將瘤體中摻雜正常組織。各組移植瘤解剖稱重后計(jì)算各組移植瘤重量平均值,同時(shí)通過(guò)與對(duì)照組平均值比較計(jì)算不同干預(yù)措施對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響及各組抑瘤率(表4)。

    表4 不同干預(yù)組瘤體重量比較

    結(jié)果顯示2Gy+氟尿嘧啶組,2Gy+西妥昔單抗組,2Gy+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組各組瘤體重量均明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而2Gy照射組雖瘤體重量低于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表5 氟尿嘧啶聯(lián)合放療組與單純放療組瘤體重量比較

    研究顯示氟尿嘧啶明顯增加了2Gy放療對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用(P<0.05,表5)。西妥昔單抗則沒有明顯增加了2Gy放療對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用(P>0.05,表6)。

    表6 西妥昔單抗聯(lián)合放療組與單純放療組瘤體重量比較

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),兩藥聯(lián)合放療組與氟尿嘧啶單藥聯(lián)合放療組瘤體重量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表7),說(shuō)明西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合并沒有明顯提高氟尿嘧啶單藥與放療聯(lián)合的作用。總體說(shuō)明西妥昔單抗無(wú)論是單藥還是聯(lián)合對(duì)放療敏感度的增加均不明顯。

    表7 兩藥同時(shí)聯(lián)合放組與氟尿嘧啶聯(lián)合放療組瘤體重量比較

    討 論

    放射生物學(xué)研究顯示EGFR通路在放射治療過(guò)程中腫瘤內(nèi)分子生物學(xué)動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮重要作用,參與了放療抵抗,因此當(dāng)EGFR拮抗劑西妥昔單抗應(yīng)用于臨床時(shí)西妥昔單抗開始與放療聯(lián)合治療頭頸部鱗癌,顯示出一定的治療效果[5]。Nasu等[6]研究顯示,C225與放療聯(lián)合可以增加肺癌移植瘤A431的放療效果,Liu等[7]研究也顯示C225與放療聯(lián)合可以增加前列腺癌細(xì)胞的放療敏感度,而Shin等[8]進(jìn)行的體外研究則顯示西妥昔單抗與放療聯(lián)合可以增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系的放療敏感度,因此西妥昔單抗與放療聯(lián)合顯示了較好的應(yīng)用前景。

    由于氟尿嘧啶與放療聯(lián)合在直腸癌術(shù)前放療中的價(jià)值已經(jīng)得到肯定并在臨床中廣泛應(yīng)用,那么將西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合,如果能進(jìn)一步提高直腸癌術(shù)前放射治療的效果將具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值,而目前尚無(wú)西妥昔單抗聯(lián)合氟尿嘧啶增加放療效果的基礎(chǔ)研究報(bào)道,筆者希望通過(guò)基礎(chǔ)研究明確西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合在直腸癌新輔助治療中的價(jià)值。

    本研究從細(xì)胞和動(dòng)物水平研究氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌放療敏感度的影響,結(jié)果顯示氟尿嘧啶、西妥昔單抗各自單藥以及兩藥聯(lián)合均可以明顯增加2Gy照射對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖以及裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),氟尿嘧啶聯(lián)合2Gy照射的抑制作用較西妥昔單抗聯(lián)合的抑制作用更強(qiáng),而且氟尿嘧啶聯(lián)合西妥昔單抗后與單用氟尿嘧啶相比并未明顯增加2Gy照射對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用(P>0.05)。

    本研究顯示氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯(lián)合使用并沒有發(fā)揮疊加或協(xié)同作用,西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯(lián)合并沒有提高放療的效果。但本研究是細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),存在明顯的局限性,目前也有一些臨床研究探討了西妥昔單抗用于放療增敏的問(wèn)題,Weiss等[9]研究顯示,將西妥昔單抗與卡培他濱及奧沙利鉑聯(lián)合并沒有進(jìn)一步提高卡培他濱與奧沙利鉑聯(lián)合放療的效果,考慮到西妥昔單抗臨床治療效果與K-ras突變有關(guān),因此Grimminge等[10]研究局部進(jìn)展期患者中基因表達(dá)與西妥昔單抗聯(lián)合化療提高局部進(jìn)展期術(shù)前放療效果的關(guān)系,結(jié)果顯示治療前EGFR、VEGFR在mRNA水平的表達(dá)以及K-ras突變是西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏效果的有效分子標(biāo)志物。

    綜上所述,總體上西妥昔單抗與化療藥聯(lián)合并沒有提高放療的效果,西妥昔單抗的臨床應(yīng)用無(wú)法改變目前氟尿嘧啶與術(shù)前放療聯(lián)合在中低位直腸癌新輔助治療中的主導(dǎo)地位,但考慮到腫瘤的異質(zhì)性,未來(lái)尋找對(duì)西妥昔單抗用于術(shù)前放療增敏效果的有效分子標(biāo)志物將是重要的研究方向。

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