miR-222及其靶基因BBC3在肝細胞癌組織中的表達及其相關性

劉志春 黨存曙 劉 彬 孫景武 趙夢杰

肝癌是臨床上常見的消化道腫瘤，由于其較高的發(fā)病率和高死亡率成為研究熱點。近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNA與肝癌的發(fā)生和發(fā)展有密切相關。microRNA是一22 nt大小的非編碼RNA，其可以抑制靶基因的表達。作為 microRNA家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)miR-222在多種腫瘤細胞中都有表達，并且會影響患者的預后。BBC3基因也叫PUMA基因，是一種受p53 基因上調表達的凋亡調控蛋白，在腫瘤中具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)BBC3是一種促凋亡基因[1-2]，因其可以被P53快速誘導并有較強的促凋亡作用而命名。研究發(fā)現(xiàn)，BBC3基因是一種p53的下游基因，在p53依賴和非依賴2種凋亡途徑過程中均有重要的作用。近幾年，BBC3基因的研究成為醫(yī)學工作者的熱點，大量的研究表明，BBC3基因與機體肝癌、直腸癌以及乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生有關[3-5]。本研究通過檢測 miR-222 及其靶基因 BBC3 在肝癌及癌旁組織中的表達水平，探討其在肝癌患者組織中表達的相關性，從而為mir-222 作為潛在肝癌治療診斷的新型分子靶點提供相應的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院普外科在2013年10月至2017年12月確診的肝細胞癌患者70例，其中男性55例，女性15例，年齡34～71歲，平均年齡(51.3±9.3)歲。取肝癌患者癌及癌周組織，其中Ⅰa期患者21例，Ⅰb期14例，Ⅱa期29例，Ⅱb期6例。所有患者均經二名病理學專家再次確認，所有病例術前未經化療和放療。正常對照組20例肝臟組織取自24 h內意外死亡者，其中男性11例，女性9例，年齡26～42歲，平均年齡(35.6±6.5)歲。肝癌組織、癌周組織以及癌灶5 cm外正常肝組織的獲得均征得患者或家屬的同意授權，并且簽署患者知情同意書，本項實驗研究通過了中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院倫理委員會的審理和批準。

納入和排除標準：①通過病理組織學檢查明確診斷為肝癌的患者；②術前7 d內完整的實驗室及影像檢查資料。正常對照組死亡原因均排除腫瘤和其它重大疾病。

1.2 方法

1.2.1 試劑和材料 總RNA快速提取試劑盒購自Generay生物公司；逆轉錄試劑盒購自MBI Fermentas公司；DMEM培養(yǎng)基及胰酶購自Hyclone公司；兔抗人BBC3多克隆抗體購自美國IBL公司；EnvisionTM兩步法免疫組化試劑盒購自Thermo Fisher公司；10%正常山羊血清購自杭州四季青公司；0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、Harris蘇木精液均購自OXIOD公司；中性樹膠、二甲苯購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.2 肝癌組織總RNA的提取 在無菌環(huán)境下取得肝臟組織，把其放入液氮冷卻的研缽中，加液氮進行研磨成均勻的粉末，加入1 ml的Trizol試劑混合并搖勻后轉移到離心管中，加入0.2 ml的氯仿混合均勻，靜置2～3 min，以12 000 r/min，4 ℃離心15 min，棄上清液；加入75%乙醇溶液進行洗滌，收集離心管內的溶液即為組織的總RNA；利用紫外分光光度計測定RNA的濃度，光密度值大于1.8的樣品進行后續(xù)試驗。

1.2.3 RT-PCR檢測miR-222基因 逆轉錄反應：采用mi-RNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。反應體系為：1.0 μl 的50 U/μl MultiScribeTMReverse Transcriptase，3 μl 的1 μmol/L逆轉錄特異性引物，0.19 μl的20 U/μl RNA 酶抑制劑，0.15 μl的100 mmol/L dNTPs，1 μl的RNA模板，1.5 μl 10 ×RT buffer，加超純水補足20 μl。反應條件：16 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 sec；產物放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Taqman real-Time PCR：應用microRNA Real-Time 試劑盒對產物進行PCR擴增，反應體系：10 μl的TaqMan GEx MASTER Mix，1 μl的realtime 特異性引物，1 μl的RT產物，用超純水補足20 μl。反應條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 sec；60 ℃，1 min，共40個循環(huán)；

miR-222 RNA表達水平的計算：以U6作為內參，測定Ct 值并計算△Ct值，△Ct = miR-222 Ct值-U6 Ct值，以2-△△CT的值作為miR-222RNA的相對表達量[6]。

1.2.4 免疫組織化學染色 利用EnvisionTM免疫組化試劑盒的說明書進行操作。把3組不同部位的組織進行切片，厚度均為44 μm，進行烤片并脫蠟水化，加入枸櫞酸鹽緩沖液后加熱20 min，對抗原進行修復。在室溫冷卻后，用PBS洗滌3 min，加入1∶25 稀釋的兔抗人BBC3多克隆抗體，放4 ℃冰箱過夜；PBS洗滌3 min，加入1∶100 稀釋的抗兔IgG在室溫孵育30 min，PBS洗滌3 min；采用DAB 顯色，蘇木精襯染以及用中性樹膠封片，在電子顯微鏡下觀察實驗結果。陰性對照組用PBS代替一抗。

1.2.5 結果判定 BB3在細胞內表達呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色，其主要在細胞質內表達，在部分細胞核內也有表達。按照Max[7]的方法對BBC3的表達結果進行判定：在400倍顯微鏡下每張切片選取3個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞平均百分率。陽性細胞概率判定方法為細胞染色輕度和陽性細胞染色得分的乘積。染色強度積分：不染色為0分，輕度染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分；染色強度積分：不染色為0分，細胞染色≤25%為1分，細胞染色>25%～50%為2分，細胞染色>50%～75%為3分，細胞染色>75%為4分。兩者積分<2分為陰性，≥2分均可判斷為陽性。陽性2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7 分為(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 肝癌患者miR-222 RNA表達水平

RT-PCR 結果顯示，miR-222 RNA表達水平在肝癌患者肝癌組織(10.85±1.85)和癌旁組織(1.94±1.13)明顯高于正常對照組(0.36±0.25)，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=3.546，P<0.05)。而肝癌組織miR-222 RNA表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.317，P<0.05)，肝癌組與正常對照組比較(t=5.321，P<0.05)；癌旁組與正常對照組比較(t=0.632，P<0.05)。

2.2 BBC3蛋白在肝癌組織細胞中的表達

BBC3 陽性染色主要在細胞質內表達，部分細胞核內也有表達，呈棕黃色顆粒。70 例肝癌組織中，BBC3 陽性表達25 例，陽性表達率為35.71%；70 例肝癌癌旁組織中，BBC3 陽性表達37 例，陽性表達率為52.86%；20例正常肝組織中，BBC3陽性表達16例，陽性表達率為80.00%。BBC3 在正常肝組織、癌旁組織及肝癌中陽性表達率依次降低。見表1。

表1 BBC3蛋白免疫組化檢測結果/例

注：BBC3陽性表達率①肝癌組與正常對照組比較，t=4.361，P<0.05；②癌旁組與正常對照組比較，t=3.587，P<0.05；③肝癌組與癌旁組比較，t=0.689，P<0.05。

2.3 miRNA-222與BBC3蛋白表達水平相關性分析

肝癌組miRNA-222與BBC3蛋白的表達水平進行supearman相關分析，miRNA-222相關系數(shù)γ=-0.497、P=0.01，提示miRNA-222與BBC蛋白表達水平顯著負相關；癌周組miRNA-222相關系數(shù)γ=-0.119、P=0.065，癌周組無統(tǒng)計學相關關系。

3 討論

肝細胞癌是最常見惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤致死患者人數(shù)第3位，肝癌的發(fā)病機制復雜，涉及到多基因、多階段的異常改變，肝癌發(fā)生的詳細分子機制仍不明確[8]。

miRNA 是一種廣泛存在于人體組織和細胞中的非編碼調控小RNA。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著非常重要的作用，miRNA的存在、缺失和表達水平變化均會對細胞的選擇和分化產生影響[9]。以前的研究表明，miR-222在肝癌組織中有異常的高表達，且對患者的病情和預后產生影響。miR-222是miR-221/222家族的一員，其定位于X染色體p11.3區(qū)域內大小約為1 kb。另外研究表明，miR-222在宮頸癌、肝癌、結腸癌以及乳腺癌等多種惡性腫瘤組織和細胞中有高表達，通過調控下游靶基因c-kit、p57、p27、Bim以及Bmf的表達，從而改變細胞增殖和凋亡過程，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10-11]。

BBC3即p53正向細胞凋亡調控因子(PUMA)基因，是2001年新發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族中BH3亞家族成員，定位在線粒體外膜，是p53作用的下游靶基因。BBC3基因具有強大的促凋亡作用并且能被快速誘導[12-13]。近年來，BBC3已成為醫(yī)學研究的熱點，許多研究表明，BBC3 與結直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關[5,14-15]。本實驗研究結果顯示BBC3在肝癌組織、癌旁組織以及正常肝組織中均有表達，BBC3蛋白表達在同一患者的肝癌組織、癌旁組織之間無差異統(tǒng)計學意義，正常肝組織與癌組織、癌旁組織之間比較，差異有統(tǒng)計學意義。初步推論BBC3在一定的條件下可以促進細胞的凋亡。但是BBC3在肝癌組織中的表達水平與肝癌的發(fā)生、發(fā)展的關系還有待進一步的研究。

本試驗結果表明miR-222在肝癌組織、癌旁組織以及正常組織中的表達依次增加。高表達miR-222肝癌組織中BBC-3蛋白的表達量明顯下調，呈現(xiàn)顯著負相關關系，從而間接證明了miR-222的靶基因為BBC-3。在本研究中，雖然癌旁組織中的miR-222的表達水平與正常組織相比明顯增加，但與BBC-3蛋白的表達無統(tǒng)計相關關系，這一現(xiàn)象未見相關文獻報道，值得進一步研究，有可能為闡明肝癌癌變機制和早期診斷肝癌提供新的方法。