聯(lián)合細(xì)胞膜片和自組裝多肽技術(shù)構(gòu)建一種新型BMSCs膜片-RADA16組織工程復(fù)合體的研究

李豆豆 周維維 王蕾 劉露 李春絨 劉思麟 曹猛

骨組織工程是組織工程學(xué)中的一個(gè)分支，它主要利用工程學(xué)的原理和方法將種子細(xì)胞復(fù)合于生物支架上形成細(xì)胞-支架復(fù)合體，最終移植于缺損處達(dá)到修復(fù)再生的目的[1]。此外，細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet technology，CST)，也稱細(xì)胞片層技術(shù)，是種子細(xì)胞利用自身的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成的數(shù)層致密細(xì)胞聚合體，也是目前骨組織工程的常用方法之一[2]。

對于理想的骨組織工程支架材料，有利于細(xì)胞粘附、增殖和分化的表面性能、合適的空隙、以及良好的生物安全性等均是十分重要的影響因素[3-4]。自組裝多肽(Self-assembled peptides，SAP)是以多肽為基本組成單元，依靠多肽分子天然自組裝得到的新穎支架材料。RADA16(AcN-RADARADARADARADA-CNH2)是一種具有納米級纖維的自組裝多肽凝膠，其纖維空隙、簡單的氨基酸成分和充分的含水量，更接近天然細(xì)胞外基質(zhì)，可作為細(xì)胞支架提供理想的三維生長環(huán)境[5-8]。

本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體，探究復(fù)合體對細(xì)胞的增殖情況以及成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要材料、儀器

實(shí)驗(yàn)動物： 8 周齡SD大鼠。 α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(Sigma，美國)； RADA16水凝膠 (Corning，美國)；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton，美國)；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、抗壞血酸、胰島素、油紅O、茜素紅(Sigma-Aldrich，美國)；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(康為世紀(jì))；CCK-8試劑盒(南京恩晶生物)；掃描電子顯微鏡(JSM-6700F，日本)；激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus Fluoview FV1000，日本)；反轉(zhuǎn)錄和定量 PCR試劑盒(Ta) (Ka) (Ra，日本)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(Prime Q，英國)；SynergyTMHT酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek, 美國)。

1.2 BMSC的分離培養(yǎng)和鑒定

SD大鼠脫頸處死，無菌條件下取股骨及脛骨，剃除肌肉。剪掉股骨和脛骨的骨骺端，露出骨髓腔，用添加青、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基沖出骨髓，輕輕吹打均勻，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、 5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記： 細(xì)胞傳至P3代，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至每EP管1×106個(gè)， 各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD45、CD90。同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對照。避光冰上孵育45 min，用500 μl PBS(含1%BSA)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

BMSCs體外誘導(dǎo)分化：選擇P3代BMSCs，以3×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長至密度達(dá)80%時(shí)，在各孔的完全培養(yǎng)液中分別加入下列誘導(dǎo)劑：①成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑(1 mmol/L地塞米松、 10 mg/L胰島素、 50 mmol/L IBMX、 吲哚美辛 0.2 mmol/L)。②成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑(1 mmol/L地塞米松、 1 mol/L β-甘油磷酸鈉、 50 mmol/L抗壞血酸)。成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)14 d后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，對誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色；成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)7 d和21 d后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，對誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞分別進(jìn)行BCIP/NBT堿性磷酸酶和茜素紅染色。

1.3 BMSC膜片和BMSC-RADA16復(fù)合體的構(gòu)建

選擇P3代細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長至密度達(dá)90%～100%時(shí)，在完全培養(yǎng)基中加入成膜誘導(dǎo)液(50 μg/ml的抗壞血酸)。

超聲波水浴降低RADA16凝膠粘度，用無菌去離子水稀釋原液1%(w/v)至0.25%，以250 μl/孔的體積加入24 孔培養(yǎng)板。小心緩慢地在凝膠表面加入培養(yǎng)基(500 μl/孔加入24 孔培養(yǎng)板)促進(jìn)凝膠化。在孵箱中孵育，第一小時(shí)內(nèi)每隔1、 10、 30 min小心更換培養(yǎng)基以平衡凝膠pH，置于孵箱中過夜。培養(yǎng)好的BMSCs膜片包裹凝膠支架，每3 天更換培養(yǎng)液。

1.4 掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察形貌

將BMSCs膜片和BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體用 3%戊二醛固定過夜，乙醇梯度脫水、冷凍干燥后噴金，掃描電鏡觀察表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)。

在 24 孔培養(yǎng)板中放置蓋玻片，BMSCs膜片和BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體培養(yǎng)14 d 后， 4% 多聚醛固定 10 min，PBS 清洗30 s，再用0.5% Triton X-100 處理 5 min。 加入200 μl 100 nm的鬼筆環(huán)肽(5 U/ml) 溶液浸沒樣本，黑暗中室溫孵育 30 min，用 100 nm 的 DAPI 染色 5 min。滴加抗熒光淬滅封片液封片，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 CCK-8測定生長曲線

選用P3代細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔培養(yǎng)板，成膜后繼續(xù)培養(yǎng)，每日在其中一板中，加入1 ml培養(yǎng)基和 100 μl CCK-8，避光置入 37 ℃ 培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 4 h。每孔吸出100 μl轉(zhuǎn)移至96 孔板，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度(A)值，激發(fā)光波長為 495 nm。記錄各孔吸光值、求其均值并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 Real-Time PCR測定細(xì)胞的成骨分化

BMSCs膜片和BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。在第 3、 7、 14 天時(shí)將各組培養(yǎng)基去除后，用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，以 20 μl體系將RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min； 85 ℃ 5 s； 4 ℃。引物根據(jù) NCBI上 Primer-BLAST 設(shè)計(jì)并經(jīng)過比對，由北京奧科合成，具體見表 1。結(jié)果以 Ct 值表示，以GAPDH為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本比較用成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05為存在顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示： P3代 BMSCs均一表達(dá)CD29，CD90，陽性率分別為99.1%、 99.8%；而CD34、 CD45呈陰性，陽性率分別為1.0%、 1.5%(圖 1)。BMSCs成脂誘導(dǎo)分化鑒定：誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞累積脂質(zhì)，脂滴變大合并呈串珠狀。經(jīng)油紅O染色呈鮮紅色 (圖 2A)。BMSCs成骨誘導(dǎo)分化鑒定：堿性磷酸酶染色可見細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)礦化顆粒沉積，染色呈藍(lán)黑色、深染顆粒(圖 2B)。茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅褐色(圖 2C)。以上結(jié)果說明培養(yǎng)細(xì)BMSCs為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

表 1 PT-PCR引物Tab 1 Primers for RT-PCR

2.2 BMSCs膜片和BMSCs-RADA16復(fù)合體的形態(tài)學(xué)觀察

BMSCs膜片、RADA16凝膠支架以及復(fù)合體大體觀如圖 3。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：膜片細(xì)胞生長狀態(tài)良好，突觸清晰，有部分細(xì)胞正在分裂， 并可見細(xì)胞間橋(圖 4A和4B)；膜片與支架材料共培養(yǎng)后，細(xì)胞在材料上伸出觸角，粘附到支架材料上，并有部分觸角向支架材料孔隙內(nèi)生長(圖 4C)。電鏡可見支架材料疏松多孔的表面形態(tài)(圖 4D)。

圖 1 BMSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果Fig 1 Identification of BMSCs by flow cytometer

A： 油紅O染色(×20)； B： BCIP/NBT堿性磷酸酶(×4)； C： 茜素紅染色(×4)圖 2 BMSCs誘導(dǎo)分化觀察A: Oil red O staining(×20); B: BCIP/NBT alkaline phosphatase(×4); C: Alizarin red staining(×4)Fig 2 Induced differentiation of BMSCs

激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：細(xì)胞核被 DAPI 染料染成藍(lán)色，細(xì)胞骨架被羅丹明-鬼筆環(huán)肽染料染成紅色。 2 組細(xì)胞生長旺盛，可以觀察到粗大的細(xì)胞骨架，其中BMSCs-RADA16復(fù)合體組細(xì)胞伸展性更好，說明細(xì)胞活性更好(圖 5)。

2.3 CCK-8測定生長曲線

細(xì)胞生長曲線結(jié)果如圖 6 顯示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 第1～2 天， 2 組間無顯著性差異(P>0.05)； 第3～8 天， BMSCs-RADA16復(fù)合體組比BMSCs膜片組細(xì)胞數(shù)量多，且兩者之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 Real-Time PCR測定成骨表達(dá)水平

PCR結(jié)果如圖 7所示： 在誘導(dǎo)3、 7、 14 d時(shí)， 復(fù)合體中成骨相關(guān)基因ALP、OCN、COL-1、RUNX2總體趨勢呈上升水平，提示與BMSCs膜片相比，復(fù)合體中BMSCs的成骨基因表達(dá)量顯著升高。

圖 3 膜片、支架及復(fù)合體大體觀Fig 3 General view of the cell sheet, scaffold and complex

A: ×1 000; B: ×5 000; C: ×10 000; D: ×20 000圖 4 BMSCs和支架形貌(SEM)Fig 4 Morphology of BMSCs and scaffold(SEM)

圖 5 DAPI 和Rhodamine phalloidin染色(LCM, ×200)Fig 5 DAPI and Rhodamine phalloidin staining (LCM, ×200)

圖 6 BMSCs曲線Fig 6 Growth Curves of BMSCs

3 討 論

組織工程是現(xiàn)代修復(fù)重建醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新思路， 組織工程兩大關(guān)鍵要素是種子細(xì)胞和生物支架。

目前，研究學(xué)者們主要通過應(yīng)用種子細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜片或?qū)⒓?xì)胞與支架材料相復(fù)合的方法來制備骨組織移植物。細(xì)胞膜片是一種細(xì)胞聚合體，在高密度接種細(xì)胞后， 通過刺激細(xì)胞分泌外基質(zhì)而形成數(shù)層致密的細(xì)胞片，具有一定的韌性和強(qiáng)度[9]。細(xì)胞膜片雖然對小面積骨缺損有一定的效果，但是當(dāng)缺損較大時(shí)，往往因?yàn)榧?xì)胞自組裝聚合能力的限制及中心營養(yǎng)供應(yīng)等問題難以構(gòu)建大體積細(xì)胞膜片移植物修復(fù)大面積的骨缺損[2]。另外，單純的細(xì)胞膜片雖然可塑性強(qiáng)，但機(jī)械強(qiáng)度欠佳，常需與其他支架材料復(fù)合來提供機(jī)械支撐的作用[9]。

圖 7 ALP，OCN，COL-1，RUNX2成骨基因相對表達(dá)量(RT-PCR)Fig 7 The relative expression levels of ALP, OCN, COL-1 and RUNX2(RT-PCR)

隨著組織工程材料的發(fā)展，細(xì)胞與支架材料復(fù)合來修復(fù)骨缺損也得到廣泛應(yīng)用。Villa等[10]將小鼠的 BMSCs 接種到膠原-羥基磷灰石支架材料上修復(fù)顱骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后3 周，可觀察到新骨形成。 有學(xué)者將細(xì)胞膜片與聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)等支架用于組織工程中，取得了一定的效果[11-12]。但有研究表明[13]， 當(dāng)PLGA降解時(shí)會產(chǎn)生酸性環(huán)境， 移植區(qū)域產(chǎn)生的酸性 pH不僅會阻礙細(xì)胞向 PLGA 支架遷移，還會導(dǎo)致細(xì)胞活性的顯著降低。尋找合適的骨組織工程支架材料，將細(xì)胞膜片與支架材料結(jié)合用于再生醫(yī)學(xué)，找到可能更優(yōu)的組織工程方法，是本實(shí)驗(yàn)的出發(fā)點(diǎn)。

自組裝多肽納米纖維支架(Self-assembled peptides nanofiber scaffolds，SAPNS) 是一類具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型生物支架，其結(jié)構(gòu)、生物功能、機(jī)械力學(xué)等特性類似天然細(xì)胞外基質(zhì)，并選擇性調(diào)控種子細(xì)胞生物學(xué)行為。生物大分子的基本特征之一是分子自組裝，通過自組裝形成水凝膠可以有效的模擬精細(xì)的生物和天然大分子物質(zhì)，是真正意義上的仿生材料。RADA16 是兩親性多肽(amphiphilic peptides， PAs)，在改變多肽溶液pH值或加入堿性陽離子的情況下，自組裝生成的一類具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的新型生物支架[14]。

多肽內(nèi)活性片段的含量約為5%，含水量超過99%，高含水量、大表面積、高孔隙率等特性使 SAPNS 以類似天然 ECM的形式包繞種子細(xì)胞，利于營養(yǎng)物質(zhì)、活性分子及氧氣等彌散，且利于細(xì)胞黏附、增殖、遷移和分化[15-17]。本實(shí)驗(yàn)中通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡等多層面觀察到細(xì)胞在支架材料上生長狀態(tài)良好；通過增殖實(shí)驗(yàn)顯示BMSCs與RADA16凝膠支架結(jié)合初期細(xì)胞數(shù)量略低，這可能與環(huán)境改變和細(xì)胞適應(yīng)有關(guān)，后期增殖速度增高并超過單純BMSCs膜片，這些均表明RADA16多肽納米纖維支架材料的生物相容性良好，對細(xì)胞毒性低。此外，研究表明[18]，在成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)條件下，RADA16多肽支架材料中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鈣含量和骨鈣素含量隨著培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢，礦化的細(xì)胞外基質(zhì)能夠遍布整個(gè)三維RADA16支架材料。該研究結(jié)果說明，RADA16可以作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的載體材料用于骨組織工程研究。本實(shí)驗(yàn)通過PCR技術(shù)對成骨相關(guān)的早期因子、晚期因子以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的檢測，顯示BMSCs膜片-RADA16中細(xì)胞的成骨能力比單純BMSCs膜片高，這可能是因?yàn)槟z創(chuàng)造了細(xì)胞生長良好的微環(huán)境，有利于細(xì)胞間生物活性信息分子的交流和傳遞。

BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體在一定程度上克服了單純BMSCs膜片操作性能差和機(jī)械性能不佳等問題；同時(shí)RADA16形成的水凝膠支架在體內(nèi)最終降解為小分子多肽和氨基酸，有良好的生物相容性；RADA16比蛋白質(zhì)有更加規(guī)整的氨基酸序列和多樣的氨基酸殘基種類，并可在其末端連接不同功能的多肽，作用在不同的靶細(xì)胞發(fā)揮特定的功能。關(guān)于BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體的性能還需要更多的體內(nèi)研究驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

自組裝多肽RADA16是一種良好的組織工程支架材料，新型的BMSCs膜片-RADA16復(fù)合體可能作為一種植入體用于組織工程中。