秸稈還田對(duì)稻田氮循環(huán)微生物及功能基因影響研究進(jìn)展

王青霞，陳喜靖，喻 曼，*，沈阿林，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310016)

農(nóng)作物秸稈富含有機(jī)物質(zhì)和氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)元素。秸稈還田既可為作物提供所需養(yǎng)分，又能為土壤微生物提供豐富碳源，刺激微生物活性，進(jìn)而促進(jìn)氮循環(huán)和礦化，提高氮肥利用率，改善土壤培肥效果[1-2]，因此，秸稈還田已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施之一。秸稈還田形式多樣，主要有粉碎后直接翻壓還田、覆蓋還田、堆漚還田和腐熟劑處理還田等，其中，秸稈粉碎后直接翻壓還田是當(dāng)前秸稈肥料化利用的主要方式[3]。

上述這些土壤中的氮素轉(zhuǎn)化大多在微生物驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行，因此越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注微生物介導(dǎo)下的水稻土中各種形態(tài)氮素的轉(zhuǎn)化過(guò)程及其相互影響機(jī)制。本文就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外秸稈還田模式下微生物介導(dǎo)的稻田氮素轉(zhuǎn)化的微生物群落及功能基因研究進(jìn)行梳理，以期為秸稈還田提高氮肥利用率提供更多理論指導(dǎo)。

1 秸稈還田對(duì)稻田微生物群落的影響

研究表明，秸稈還田配施化肥能顯著提高土壤微生物數(shù)量，尤其是氨氧化細(xì)菌、固氮菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和纖維分解菌等氮素轉(zhuǎn)化功能菌的數(shù)量，進(jìn)而對(duì)土壤氮素循環(huán)產(chǎn)生重要影響。但也有研究表明，秸稈還田會(huì)減少土壤有機(jī)質(zhì)積累和微生物多樣性[3]，對(duì)土壤微生物群落組成和功能產(chǎn)生強(qiáng)烈影響[13]。隨著秸稈不斷分解，土壤微生物可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量減少，會(huì)進(jìn)一步抑制土壤微生物活性[14]。

土壤微生物的數(shù)量及活性主要取決于土地利用類型、pH值及有機(jī)質(zhì)含量，當(dāng)這些因素不同，且秸稈還田量和年數(shù)不同時(shí)，其對(duì)稻田微生物群落的影響也不盡相同[15]。

1.1 pH值

在pH值5.77的成都平原區(qū)，秸稈還田翻耕處理的土壤氨氧化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和固氮菌分別較對(duì)照增加了1.9倍、1.8倍和22.7倍，免耕處理的固氮菌增加了25.0倍，但氨氧化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的數(shù)量略有降低；在pH值6.38的川中丘陵區(qū)，翻耕處理的氨氧化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和固氮菌數(shù)量分別較對(duì)照增加了25.0倍、2.6倍和7.5倍，免耕處理的氨氧化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和固氮菌分別較對(duì)照增加了10.4倍、1.7倍和1.5倍[16]。

1.2 有機(jī)質(zhì)含量

川中丘陵區(qū)秸稈還田處理較對(duì)照減少了土壤反硝化細(xì)菌數(shù)量，但在有機(jī)質(zhì)含量較高的平原區(qū)無(wú)此明顯規(guī)律。這可能與有機(jī)碳含量有關(guān)[16]。土壤有機(jī)質(zhì)含量的提高會(huì)增加土壤微生物碳含量及微生物數(shù)量，促進(jìn)活性酶的產(chǎn)生[17]。

1.3 土地利用類型

在長(zhǎng)期連作土壤中，秸稈深埋較秸稈覆蓋更能增加土壤細(xì)菌、放線菌、氨氧化細(xì)菌、好氣性固氮菌、硝化細(xì)菌的數(shù)量，而在輪作土壤中，秸稈還田方式對(duì)根際土壤真菌和主要微生物生理類群的影響不大。長(zhǎng)期連作后，土壤微生物單一，多樣性差，細(xì)菌生理類群數(shù)量相對(duì)較少。秸稈深埋后，其腐解速率大于秸稈覆蓋還田處理，能改善耕作的犁底層，保蓄水分，有效提高土壤有益微生物的數(shù)量和酶活性[18]。

1.4 秸稈還田量

通常高秸稈還田率易改變微生物群落結(jié)構(gòu)，提高大部分水解酶的活性，而低秸稈還田率對(duì)其影響較小[19]。秸稈還田對(duì)微生物的影響隨著還田量的增加先增加后減小，翻耕條件下以2/3還田量處理的土壤微生物數(shù)量和活性較高，免耕條件下1/3還田量處理的提高作用顯著[20]。

1.5 秸稈還田年限

短期秸稈還田對(duì)作物氮和土壤無(wú)機(jī)氮的貢獻(xiàn)率較低，對(duì)淹水條件下土壤氮素礦化和作物氮素吸收影響不大；長(zhǎng)期秸稈還田可以改善土壤肥力，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，加快氮素吸收[21]。因此，試驗(yàn)?zāi)陻?shù)不足可能會(huì)影響相關(guān)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 秸稈還田對(duì)稻田氮素轉(zhuǎn)化功能基因的影響

土壤的氮素循環(huán)主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和銨還原過(guò)程，主要由固氮微生物、硝化功能菌、反硝化功能菌和硝酸鹽異化還原成銨過(guò)程(DNRA)功能微生物驅(qū)動(dòng)[22]，如圖1所示。目前，廣泛使用分子標(biāo)記，如nifH、amoA、nirK、nirS和nrfA基因來(lái)研究土壤氮循環(huán)微生物。氮循環(huán)過(guò)程對(duì)應(yīng)的基因包括：氮固定的nifH基因，硝化作用的amoA基因，反硝化作用的nirK和nirS基因，以及DNRA的nrfA基因。它們的拷貝數(shù)通常被用來(lái)指示氮循環(huán)微生物豐度[23]。

2.1 固氮微生物

圖1 微生物參與的氮循環(huán)過(guò)程[22]Fig.1 Nitrogen cycling process by microorganism[22]

土壤中固氮基因nifH的多樣性受到土壤耕作制度、植被類型、土壤理化性質(zhì)等諸多因素的影響，只有綜合考慮各個(gè)因素的效應(yīng)才能提高土壤的固氮效率，進(jìn)而提高土壤中氮肥的生物有效性。劉驍蒨等[27]研究表明，秸稈覆蓋配施足夠的氮磷鉀肥能夠維持土壤充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，防止植物與微生物爭(zhēng)氮，有利于固氮細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，且秸稈覆蓋處理相對(duì)于無(wú)秸稈處理，固氮菌多樣性指數(shù)及其豐度顯著增加。楊濱娟等[28]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田配施化肥能夠增加好氣性自生固氮菌的數(shù)量，而普通區(qū)組間差異不顯著。秸稈還田后能夠通過(guò)礦化和降解作用釋放氮以補(bǔ)償植物和微生物的可用氮庫(kù)，固氮微生物可以直接從秸稈還田處理的土壤中吸收氮，不需要固氮消耗能量，因此秸稈還田可能會(huì)導(dǎo)致nifH基因表達(dá)水平和固氮活性下降。然而，有研究表明，秸稈還田處理的nifH基因拷貝數(shù)仍高于無(wú)秸稈還田處理[29-30]。這說(shuō)明秸稈還田可以提高土壤自身固氮能力，對(duì)土壤肥力的提高產(chǎn)生持久影響?？傮w來(lái)看，這些研究主要集中在固氮菌數(shù)量和多樣性的分析上，缺乏對(duì)秸稈不同還田方式和化肥配施下固氮基因響應(yīng)機(jī)理和驅(qū)動(dòng)因子的研究，因此很難明確何種秸稈還田方式能有效、持久地提高稻田固氮能力。

2.2 硝化功能菌

硝化作用包括2個(gè)過(guò)程：氨在氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria， AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea， AOA)的作用下被氧化為亞硝，然后亞硝在亞硝酸氧化細(xì)菌(nitrite-oxidizing bacteria， NOB)作用下被氧化為硝酸鹽[31]。氨的氧化主要靠氨氧化細(xì)菌來(lái)完成，部分古細(xì)菌同樣參與這一重要的生化反應(yīng)過(guò)程。大量研究表明，氨氧化細(xì)菌主要集中于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)和亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)等5個(gè)屬[32]。執(zhí)行硝化作用第二步的亞硝酸氧化菌主要有硝化桿菌(Nitrobacter)、硝化刺菌(Nitrospina)、硝化球菌(Nitrococcus)和硝化螺菌(Nitrospira)?？寺∥膸?kù)分析顯示，硝化螺菌在水稻土中豐度最高[33]。現(xiàn)在，有一種新的氨氧化過(guò)程——厭氧氨氧化在水稻土中被發(fā)現(xiàn)[34]。目前已知的厭氧氨氧化菌Candidatusbrocadia、Candidatuskuenenia、Candidatusscalindua、Candidatusanammoxoglobus、Candidatusjettenia全部歸屬于Brocadiales目。

細(xì)菌和古細(xì)菌均具有編碼氨單加氧酶(AMO)的amoA功能基因，其具有一定的序列保守性，通常用來(lái)標(biāo)記硝化過(guò)程。編碼經(jīng)胺氧化酶(HAO)的基因hao，也是研究氨氧化階段的標(biāo)記基因。氨氧化細(xì)菌屬于化能自養(yǎng)型微生物，廣泛分布于湖泊、底泥、土壤和海洋環(huán)境中。水稻土常處于淹水狀態(tài)，但水稻土表層含氧量較高，仍可進(jìn)行硝化作用[35]。長(zhǎng)期秸稈還田能提高水稻土中可利用碳含量，促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)氨的競(jìng)爭(zhēng)利用使優(yōu)勢(shì)種群突出，非優(yōu)勢(shì)種群的發(fā)展被抑制，從而降低水稻土中amoA和hao基因群落的多樣性，改變細(xì)菌群落組成，并導(dǎo)致氨氧化菌群的富集[36]。眾多研究已經(jīng)證實(shí)，有機(jī)碳是驅(qū)動(dòng)amoA變化的重要因子。Jin等[37]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥或秸稈配施化肥會(huì)提高土壤中amoA和nirK的拷貝數(shù)，其中，amoA與土壤有機(jī)碳、全氮有關(guān)，nirK則與土壤有機(jī)碳、全氮、全磷相關(guān)。研究證明，秸稈還田配施化肥會(huì)通過(guò)有機(jī)碳的積累改變水稻土中硝化基因群落結(jié)構(gòu)，提高硝化功能菌的豐度。因此，有研究者試圖通過(guò)秸稈生物炭調(diào)節(jié)amoA基因來(lái)控制水稻土中N2O的排放[38-39]。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，稻田水分條件突變會(huì)影響N2O通量，影響氨氧化細(xì)菌和脫氮細(xì)菌群落生長(zhǎng)的硝化細(xì)菌和脫氮細(xì)菌功能基因，隨著含水量增加，功能基因豐度也會(huì)增加[40]。對(duì)于秸稈還田模式下的稻田，必須結(jié)合水分管理，厘清稻田中其他養(yǎng)分的影響，從而動(dòng)態(tài)調(diào)控稻田中硝化基因的變化，平衡系統(tǒng)中的氮素有效轉(zhuǎn)化，減少氮的排放與流失，提高氮素利用率。

2.3 反硝化功能菌

細(xì)菌、真菌和古細(xì)菌等種類繁多的微生物均參與反硝化過(guò)程[43]，且是在硝酸鹽還原酶(nar)、亞硝酸鹽還原酶(nir)、氧化氮還原酶(nor)和氧化亞氮還原酶(nos)4種酶的連續(xù)催化下完成的[32]。反硝化過(guò)程也可以看作是不同種類微生物共同作用的結(jié)果，因此對(duì)反硝化微生物的研究相對(duì)困難[33]。目前，亞硝酸鹽還原酶nirS、nirK基因和氧化亞氮還原酶nosZ常被用作反硝化細(xì)菌的分子標(biāo)記。反硝化細(xì)菌是一類異養(yǎng)型兼性厭氧細(xì)菌。在土壤中，反硝化作用主要受到鹽度、pH、溶解性無(wú)機(jī)氮(DIN)、溶解性有機(jī)碳(DOC)、溫度的影響[22]。水稻淹水期以厭氧環(huán)境為主，因此反硝化作用是稻田氮素轉(zhuǎn)化的主要途徑[34]。反硝化速率與反硝化微生物的豐度并不總是相關(guān)的。反硝化是一種機(jī)會(huì)性生長(zhǎng)機(jī)制，可以依賴其他電子受體而活躍和生長(zhǎng)。當(dāng)前DNA數(shù)據(jù)只能證實(shí)微生物存在的信息，反映環(huán)境因素變化對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，卻沒(méi)有關(guān)于代謝活性的數(shù)據(jù)[44]。蔚霞[41]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田后土壤中反硝化速率降低，這可能與該實(shí)驗(yàn)沒(méi)有配施氮肥有關(guān)，氮肥施用會(huì)促進(jìn)土壤反硝化作用。王沛譞等[32]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)cry1Ac/cpti雙價(jià)抗蟲(chóng)基因水稻的秸稈還田降解對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物群落豐度與組成沒(méi)有明顯影響， 不存在影響土壤氮素轉(zhuǎn)化及N2O排放的可能，但由于土壤中產(chǎn)生N2O的途徑多樣，且有多種酶參與反應(yīng)，故還需要進(jìn)一步的研究來(lái)深入揭示轉(zhuǎn)基因秸稈對(duì)稻田土壤N2O 排放的影響及機(jī)制。Azziz等[44]研究發(fā)現(xiàn)，nirS型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境因子比nirK型更敏感，有機(jī)質(zhì)含量是影響nirS型反硝化菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素，而nirK基因不受土壤類型和水稻品種的影響，nirS和nirK基因豐度會(huì)隨著水稻生長(zhǎng)周期的變化而變化。

近年來(lái)關(guān)于稻田反硝化基因的研究很多是圍繞N2O排放展開(kāi)的，重在探究水稻土中氮通量、N2O濃度以及其中的微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制[42，45]。Cucu等[46]研究發(fā)現(xiàn)，施用氮的氣體損失(主要為N2)在無(wú)秸稈添加時(shí)高達(dá)60%，而在有秸稈時(shí)僅為20%，說(shuō)明連續(xù)秸稈還田會(huì)減少N2O排放。古菌nosZ基因?qū)Ψ聪趸饔玫母哌m應(yīng)性可能會(huì)成為減少N2O排放的一個(gè)關(guān)鍵特征，同時(shí)在秸稈還田的情況下，細(xì)菌nosZ基因也會(huì)促進(jìn)反硝化作用的完成。這些研究都表明，秸稈還田配施化肥會(huì)導(dǎo)致反硝化速率提高。反硝化底物包括氮素和有機(jī)質(zhì)，秸稈進(jìn)入土壤能顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)儲(chǔ)量，明顯改善土壤有機(jī)質(zhì)的活性和質(zhì)量[47]。化肥和秸稈都可以作為氮源為微生物提供養(yǎng)分，但其中不同基因?qū)Νh(huán)境因子的響應(yīng)程度不一。要減少秸稈還田對(duì)環(huán)境造成的負(fù)面影響，深入細(xì)致探討介導(dǎo)反硝化每一個(gè)步驟中的關(guān)鍵基因顯得尤為重要。

2.4 DNRA功能菌

3 總結(jié)與展望

從秸稈還田對(duì)稻田微生物群落及功能基因影響的相關(guān)研究文獻(xiàn)看，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)水稻土中氮素的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化研究主要集中在形態(tài)變化，以及土壤理化性質(zhì)變化對(duì)其造成的影響方面，缺乏在關(guān)鍵微生物和功能基因水平上驅(qū)動(dòng)機(jī)制的信息，因此，氮素的利用效率和有效轉(zhuǎn)化機(jī)制往往被削弱。對(duì)于水稻種植過(guò)程中何種環(huán)境下，哪些功能微生物對(duì)氮素的有效轉(zhuǎn)換起主導(dǎo)作用尚不明確。目前，秸稈還田對(duì)土壤生態(tài)過(guò)程的影響研究仍然不夠全面系統(tǒng)，筆者認(rèn)為以下幾個(gè)方面需要加以更多關(guān)注。

1)土壤微生物與稻田氮素?fù)p失的相互關(guān)系。土壤的化學(xué)和物理性質(zhì)，如氮源、碳源、水分和pH值等的變化會(huì)對(duì)氮素轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響，但這些性質(zhì)變化只是通過(guò)改變微生物生存環(huán)境間接地影響相關(guān)微生物的功能，而氮素轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是土壤微生物參與的生物化學(xué)過(guò)程。因此，研究微生物對(duì)氮素轉(zhuǎn)化的作用機(jī)理才是研究氮素?fù)p失的關(guān)鍵。

2)秸稈還田下稻田氮素轉(zhuǎn)化功能微生物及功能基因的變化與調(diào)控。稻田土壤中氮素轉(zhuǎn)化功能微生物活性與氮素轉(zhuǎn)化基因組成、數(shù)量的關(guān)系目前并不清楚，尤其是秸稈還田后對(duì)氮素轉(zhuǎn)化功能微生物的影響，以及這些微生物的變化是如何來(lái)調(diào)控氮素轉(zhuǎn)化速率和酶的生成也都不得而知。

3)氮循環(huán)功能微生物的多樣性研究。隨著分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)于氮循環(huán)功能微生物的研究已經(jīng)不僅僅局限于分離培養(yǎng)，而應(yīng)更多地把目光集中在未分離培養(yǎng)的微生物多樣性研究上。

總之，深入研究稻田微生物介導(dǎo)的氮素轉(zhuǎn)化，厘清起主導(dǎo)作用的功能微生物、功能基因的變化和驅(qū)動(dòng)因子之間的關(guān)系，有利于稻田氮肥減施增效管理，提高稻田生態(tài)健康水平。