祛風(fēng)舒筋丸對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠免疫調(diào)節(jié)及血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)的影響

張瑤，屠瑩，胡占嵩，陳麗娟

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis， RA)為自身免疫性疾病，全世界發(fā)病率約0.5%～1%，我國發(fā)病率約0.4%，女性的發(fā)病率高于男性[1-2]。該病以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥以及軟骨和骨的破壞為其主要特點(diǎn)[3]，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，影響病人的生活質(zhì)量。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)理論中“痹癥”范疇，發(fā)病初期因風(fēng)寒濕邪侵入經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)，導(dǎo)致氣血不通，故為風(fēng)寒濕痹型，以祛風(fēng)散寒，利濕宣痹等功效中藥施治[4]。祛風(fēng)舒筋丸目前收載于2015版《中國藥典》[5]，該藥由防風(fēng)、牛膝、秦艽、威靈仙等十八味中藥制成，有祛風(fēng)散寒，除濕活絡(luò)之功效，用于治療風(fēng)寒濕閉阻所致的關(guān)節(jié)疼痛、屈伸不利、四肢麻木等癥狀。目前對祛風(fēng)舒筋丸研究多為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立[6]，對其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究鮮有報道。大鼠弗氏完全佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的發(fā)病機(jī)制和特征與臨床上的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎較為接近[7]，本研究自2016年10月至2017年3月通過佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探究祛風(fēng)舒筋丸對模型大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用以及對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響，為該藥用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，清潔級動物，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號 SCXK-(京)-2016-0011。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2藥物及試劑祛風(fēng)舒筋丸(北京寶樹堂科技藥業(yè)有限公司，規(guī)格60 g/100丸)；弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)；白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司，0.3 g/粒)；刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、噻唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)粉(美國Gibco公司)；多聚甲醛、二甲基亞砜(天津光復(fù)化學(xué)試劑有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(天津百特醫(yī)療用品有限公司)；風(fēng)濕因子(RF)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(南京建成科技有限公司)；VEGF、ICAM-1免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

試劑配制：將生理鹽水和弗氏完全佐劑在臨用配制前充分搖勻。取適量生理鹽水與弗氏完全佐劑經(jīng)雙注射器充分乳化1 h(經(jīng)三通接口反復(fù)抽推乳化成油包水乳劑)，配置成 10 mL 的弗氏完全佐劑生理鹽水乳劑。

1.3實驗儀器超凈工作臺(天津艾克瑞特實驗室設(shè)備有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Electron 公司)；酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)；小型臺式冷凍離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立 取雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量(250±20) g，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。在進(jìn)行酒精常規(guī)消毒左足趾和尾根部后，用微量注射器于每只大鼠左后足足趾皮下注射 0.1 mL 的弗氏完全佐劑生理鹽水乳劑，尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射上述乳劑 0.1 mL 致炎，空白組(隨機(jī)取10只大鼠)用同樣方法于其相應(yīng)部位注射 0.2 mL 生理鹽水。分別于初次造模第6天和第12天后注射乳劑0.2 mL以加強(qiáng)免疫炎癥反應(yīng)，建立大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。造模后第12天，按照關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritic Index， AI)的評分[8](評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無關(guān)節(jié)紅腫；1分，關(guān)節(jié)發(fā)紅而不腫脹；2分，關(guān)節(jié)輕度紅腫；3分，關(guān)節(jié)中度紅腫；4分，關(guān)節(jié)重度紅腫，不能負(fù)重。AI=四肢關(guān)節(jié)評分之和。各組評分>4分認(rèn)為造模成功，AI<4分的大鼠從實驗組中剔除)。將造模成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即模型組、白芍總苷膠囊組、祛風(fēng)舒筋丸低、中、高劑量組，每組10只，共計50只。在造模后的第12天分別測量并記錄左后足趾厚度后，灌胃給藥。白芍總苷膠囊組給藥劑量為0.27 g/kg，祛風(fēng)舒筋丸低、中、高劑量組(2.16、10.8、21.6 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量的1、5、10 倍)，每只大鼠灌胃2 mL，空白組和模型組給予等量生理鹽水，共給藥18 d。

1.4.2祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響 在造模前及給藥治療前后觀察各組大鼠活動狀態(tài)變化及關(guān)節(jié)紅腫情況，于造模前、造模后第12天、造模后第17天、造模后第21天、造模后第25天、造模后第29天用游標(biāo)卡尺測量左后足趾厚度，比較治療后各組足趾腫脹程度的變化。計算：腫脹度=造模后足趾厚度-造模前足趾厚度。

1.4.3祛風(fēng)舒筋丸對大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 實驗第30天，即給藥18 d后眼球放血處死大鼠，無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，常規(guī)制備單個脾細(xì)胞懸液，活細(xì)胞大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL，加入96 孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，再加入含Con A 或LPS的RPMI-1640液100 μL(Con A的終濃度為5 mg/L，LPS的終濃度為10 mg/L)，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔滴加MTT(5 mg/mL)20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液后滴加二甲基亞砜200 μL，于酶標(biāo)儀570 nm 處比色測定吸光度值。

1.4.4大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的檢測 實驗第30天眼球放血處死大鼠，將全血以3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取血清，-20 ℃保存，按照ELISA試劑盒說明書方法測量血清RF、IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量。

1.4.5大鼠滑膜組織VEGF及ICAM-1蛋白表達(dá)的檢測 實驗第30天，即給藥18 d后處死大鼠，仰位固定，酒精消毒處理，去皮毛及肌腱組織，打開膝關(guān)節(jié)腔可見滑膜組織，將其剝離并放入4%多聚甲醛中固定2 h，經(jīng)梯度酒精逐級脫水，石蠟包埋，按VEGF及ICAM-1免疫組化試劑盒的具體步驟操作。

2 結(jié)果

2.1祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響各實驗組于弗氏完全佐劑三次致炎造模后第12天給藥，致炎造模后，各組大鼠足趾均明顯腫脹。造模后第12、17天祛風(fēng)舒筋丸高、中劑量組的足趾厚度均與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后第21、25、29天祛風(fēng)舒筋丸高、中劑量組的足趾厚度均與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，低劑量組的足趾厚度與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且高劑量組顯示了持續(xù)穩(wěn)定的足趾腫脹抑制作用，效果與白芍總苷組接近，結(jié)果見表1。

2.2祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響本研究分別采用Con A誘導(dǎo)的大鼠T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖實驗來評價祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響和對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。模型組吸光度與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，祛風(fēng)舒筋丸高劑量組和白芍總苷組分別對Con A和LPS誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖能力有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且與白芍總苷組接近；中、低劑量組對淋巴細(xì)胞增殖能力亦有一定的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表1 祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響

注：整體分析為兩因素重復(fù)測量方差分析。兩兩組間比較為LSD-t檢驗，與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01

表2 祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖的影響

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01

2.3大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α含量的檢測研究證實RF 以其高敏感性作為臨床上類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的損傷程度及病情預(yù)后判斷的重要指標(biāo)[9]。IL-1β、IL-6及TNF-α等細(xì)胞炎性因子的表達(dá)失衡是RA發(fā)病的重要因素[10-11]。實驗結(jié)果顯示與模型組比較，祛風(fēng)舒筋丸高劑量組和白芍總苷組能極顯著降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量(P<0.01)，祛風(fēng)舒筋丸中、低劑量組能顯著降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的含量(P<0.05)，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，結(jié)果見表3。

2.4大鼠滑膜組織VEGF和ICAM-1表達(dá)的檢測

本研究采用免疫組化檢測大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF與ICAM-1的蛋白表達(dá)，實驗結(jié)果顯示與模型組比較，祛風(fēng)舒筋丸高劑量組和白芍總苷組能極顯著降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織VEGF與ICAM-1蛋白的表達(dá)(P<0.01)，中、低劑量組能顯著降低VEGF與ICAM-1蛋白的表達(dá)(P<0.05)，且對表達(dá)的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，結(jié)果見表4。

表3 祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清RF、IL-1β、IL-6及TNF-α的影響

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01

表4 祛風(fēng)舒筋丸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織VEGF和ICAM-1表達(dá)的影響

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與空白組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

RA以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)，病灶中的滑膜細(xì)胞持續(xù)釋放細(xì)胞因子，造成增生異常并導(dǎo)致病變[12]。本研究中在造模后期(第21～29天)，祛風(fēng)舒筋丸的中、高劑量組大鼠足跖腫脹均有所減輕，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，高劑量組的效果與白芍總苷組接近，該實驗結(jié)果符合該動物模型的特點(diǎn)，證實祛風(fēng)舒筋丸可以相對延緩類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人癥狀的后期進(jìn)展，在提高生活質(zhì)量方面有著積極的作用。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗是是采用體外刺激物(Con A等)刺激淋巴細(xì)胞，使其體積增大，蛋白與核酸合成增加并轉(zhuǎn)化為具有分裂能力的淋巴母細(xì)胞。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率可用來判斷藥物對機(jī)體的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用[13]。RA作為一種自身免疫性疾病，始于致病抗原被T細(xì)胞所識別和激活，繼而引發(fā)T細(xì)胞增殖和B細(xì)胞的活化增殖，導(dǎo)致滑膜新生血管形成，產(chǎn)生細(xì)胞因子[14]。實驗研究顯示祛風(fēng)舒筋丸可以顯著抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖，且作用有劑量依賴性，說明祛風(fēng)舒筋丸可通過抑制T淋巴和B淋巴細(xì)胞增殖從而抑制模型大鼠的細(xì)胞免疫功能。

RA屬于血管增生性疾病，其基本病理變化為滑膜炎和血管翳的形成，其中包括多種細(xì)胞因子、抗原抗體及粘附分子參與[19]。VEGF為目前已知作用最強(qiáng)，特異性最高的血管生長因子[20]，可以特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移，促進(jìn)血管翳的形成。ICAM-1可導(dǎo)致滑膜細(xì)胞的移行增生，在細(xì)胞激活過程中提供輔助刺激因子，使白細(xì)胞停滯在炎癥局部[21]。因此關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF與ICAM-1的表達(dá)水平可以反映炎癥的變化程度。研究發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)舒筋丸高、中、低劑量組均能顯著降低VEGF與ICAM-1蛋白的表達(dá)，且對表達(dá)的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，推測該藥可能通過抑制VEGF和ICAM-1的表達(dá)，從而阻斷滑膜血管新生和血管翳形成，阻止巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向局部移行，抑制關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥的產(chǎn)生。

綜上所述，祛風(fēng)舒筋丸抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制可能與抑制T淋巴和B淋巴細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，抑制IL-1β、IL-6及TNF-α等細(xì)胞因子生成，抑制VEGF和ICAM-1的表達(dá)阻斷滑膜血管新生，抑制炎癥細(xì)胞浸潤與滲出有關(guān)。