蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化特性的影響

寧 粵，歐陽雅琦，鄭汝婷，侯愛香

(湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術學院，長沙 410128)

蕨菜具有清熱利濕、消腫、利水、安神等藥用價值[1-2]。有研究者對蕨菜中黃酮、多糖類功能成分等進行提取探索，如采用乙醇回流法提取蕨菜中的總黃酮、采用超聲波法提取蕨菜中的水溶性膳食纖維和多糖，其提取率分別可達10.33%、36.01%和25.69%[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，蕨菜中黃酮類化合物和多糖均可以較好地清除DPPH自由基，二者在一定濃度范圍內(nèi)均與DPPH自由基的清除率呈正相關[6]。國內(nèi)目前更多的研究是對蕨菜進行加工處理，也有新鮮蕨菜加木糖醇、檸檬酸等輔料，以生產(chǎn)適合糖尿病等患者食用的功能性飲料[7]，但這些蕨菜研究開發(fā)中，普遍忽視了蕨菜作為日常佐餐菜肴是否危害人體健康的問題。M Campos-Da-Paz等[8]研究表明，用蕨菜提取物單獨處理細胞，細胞會表現(xiàn)出染色質(zhì)縮合、細胞質(zhì)體積丟失等凋亡形態(tài)學特征，并且蕨類植物中的有害物質(zhì)會增加胃癌發(fā)病率和上消化道腫瘤的發(fā)生風險[9-10]，蕨菜中含有的蕨苷可以通過降低CD8+T細胞的激活和在hpv誘導的病變中的脫粒，發(fā)揮免疫抑制作用，而增加病毒持久性和侵襲性，并促進腫瘤形成[11]。這些研究結論與本課題組前期研究結果相符，筆者發(fā)現(xiàn)，1g/mL的蕨菜液平均縮短秀麗隱桿線蟲壽命6.06d，對生殖能力損害較強[12]。保持體內(nèi)自由基和抗氧化劑的平衡可以延緩衰老[13-14]?；钚匝踝?ROS)是含有氧并具有高反應活性的一類自由基或分子[15]，通過對細胞膜結構、蛋白分子等產(chǎn)生氧化作用或自身含量增多導致機體氧化應激反應造成細胞損傷而引起其結構和功能障礙[16]。機體通過利用超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等酶類可去除細胞生成的ROS[17]而維持ROS的平衡，谷胱甘肽(GSH)也是一種具有清除自由基的作用的三肽類組織，且?guī)缀醮嬖谟谏眢w的每一個細胞[18]。

通常自由基的檢測較為困難，本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物測定ROS水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、SOD、CAT，BCA法測秀麗隱桿線蟲總蛋白的方法，間接測定其體內(nèi)自由基含量[19]，進而了解其抗氧化作用。因秀麗隱桿線蟲與人體基因相似，為進一步研究蕨菜液的生理功能，探索蕨菜食用安全性，本研究參考中國人將蕨菜植株去頭去尾后腌制或烹制的采食習慣，繼續(xù)以秀麗隱桿線蟲為模式生物，測定喂食蕨菜液后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量，GSH-Px、SOD、CAT活力以及細胞凋亡情況，對蕨菜體內(nèi)抗氧化作用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕨菜，湖南湘西雪峰山。野生型秀麗隱桿線蟲以及大腸桿菌OP50，湖南農(nóng)業(yè)大學實驗室。NGM培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、M9緩沖液、2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯(H2DCF-DA)；GSH-Px測試盒、SOD測試盒、CAT測試盒、秀麗隱桿線蟲總蛋白試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面凈化操作臺，蘇州凈化設備有限公司；立式滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實驗有限公司；連續(xù)變倍體式顯微鏡，MoticSMZ-168型，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；MJX-250B-Z電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；超聲波細胞粉碎機，南京舜瑪儀器設備有限公司；Varioskan Flash多功能酶標儀，美國Therm Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1蕨菜提取液的制備

(1)新鮮蕨菜提取液的制備：取去頭去尾的新鮮野生蕨菜100g切碎，加100mL蒸餾水榨汁，紗布過濾，取濾液滅菌，制成1.00g/mL和0.2g/mL的新鮮蕨菜提取液。(2)腌制蕨菜水溶提取液的制備：取去頭去尾的新鮮野生蕨菜進行腌制，再取腌制蕨菜100g切碎，加100mL蒸餾水榨汁，紗布過濾，取濾液滅菌，制成1.00g/mL和0.2g/mL的腌制蕨菜提取液。

1.3.2秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)及同期化 參照文獻[20]的方法并做適當修改：用無菌水進行沖洗平板，收集帶有蟲液的無菌水于錐形管，用無菌水離心(2 000r/min，2min)洗3次，每次離心后去上清再加適量無菌水(目的在于洗去大腸桿菌)。加入裂解液(1.5mLNaClO、3.5mL無菌水、5mL NaOH)于錐形管，50mL蟲液對應10mL裂解液，蟲液密度大時適當增加裂解液的量。放在漩渦震蕩儀上震蕩至蟲體均破碎(在顯微鏡下觀察)，即為卵懸液。加入與裂解液等體積的M9緩沖液離心(3 000r/min，2min)洗3次，每次離心后去上清再加適量M9緩沖液(目的在于洗去裂解液)。用完全培養(yǎng)基再離心清洗1次(3 000r/min，2min)以洗去M9緩沖液，去上清后，將卵懸液轉(zhuǎn)移至錐形瓶，用完全培養(yǎng)基定容至50mL。將錐形瓶放在搖床上20℃培養(yǎng)29h。29h后加入大腸桿菌1.5mL(每毫升蟲液加入30μL大腸桿菌)搖床20℃培養(yǎng)38h。

1.3.3秀麗隱桿線蟲給藥操作 向經(jīng)38h培養(yǎng)的蟲液中加入配好的FUDR試劑繼續(xù)培養(yǎng)12h(加入FUDR抑制產(chǎn)卵)，加入提取液進行處理24h，分5管各為新鮮蕨菜提取液0.2、1.0g/mL和腌制蕨菜提取液0.2、1.0g/mL以及空白對照組(加等量蒸餾水)。

1.3.4秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的測定 給藥24h后，將盛有線蟲的錐形管離心去上清，并用PBS定容至3mL，再于超聲波細胞破碎儀以破碎功率800 W、破碎總時間8min為超聲參數(shù)對線蟲進行破碎。在顯微鏡下觀察，待蟲體裂解后，將混合液5 000r/min離心10min，將上清液小心轉(zhuǎn)移至新離心管中，冰水浴冷卻，5 000r/min離心10min，上清液即為酶液提取液，將酶液提取液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5秀麗隱桿線蟲體ROS水平的測定

(1)ROS水平的測定：給藥24h后，將蟲液離心(2 500r/min，2min)去上清(除去培養(yǎng)液)，用PBST離心(2 500r/min，2min)洗滌秀麗隱桿線蟲2次，以除去OP5O及雜質(zhì)；再于超聲波細胞破碎儀以破碎功率900 W、破碎總時間12 s(超聲3 s、間隔3 s)為超聲參數(shù)對線蟲進行破碎。在顯微鏡下觀察，待蟲體裂解后，將混合液5 000r/min離心10min，將上清液小心轉(zhuǎn)移至新離心管中，冰水浴冷卻，5 000r/min離心10min，取上清即組織液于新的1.5mL離心管中。嚴格按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒說明書要求，進行線蟲總蛋白測定并記錄數(shù)據(jù)。同時進行ROS水平的測定，向96孔板中加入80μL組織液，再加入20μL H2DCF-DA；將96孔板放置于20℃搖床孵育30min，并蓋上蓋子，以免蒸發(fā)；利用多孔化學發(fā)光檢測儀進行熒光檢測，激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm。

(2)數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理：采用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，結果以百分比呈現(xiàn)。

1.3.6秀麗隱桿線蟲細胞凋亡的影響分析 吸取各組蟲液各100μL于96孔板，加入100μL吖淀橙，染色1.5h(避光)后，用M9洗滌，挑取用M9洗滌過的線蟲于NGM板上，使線蟲恢復活力10min。用3%的瓊脂糖制作瓊脂平面，待凝固吸取1滴100μg/mL疊氮化鈉于瓊脂平面中央，再挑取10～15條蟲于溶液中，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，通過與對照組熒光強度大小以及各組相互之間熒光強度的對比來進行判斷。

2 結果與分析

2.1 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT活力分析

如圖1所示，與對照組相比，新鮮蕨菜液和腌制1.0g/mL組均可抑制線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶的活性，而腌制0.2g/mL組對線蟲GSH-Px活性也有抑制作用卻不如前兩組明顯，但對CAT和SOD兩種酶活性有輕微的抑制作用。4組不同處理的蕨菜液均對線蟲GSH-Px活力有抑制作用，但效果并不一致，2組新鮮蕨菜液作用效果差別不大，線蟲體內(nèi)GSH-Px活力分別為對照組的0.58、0.56倍，而2組腌制蕨菜液作用效果差別同樣很小，線蟲體內(nèi)GSH-Px活力分別為對照組的0.83、0.9倍，其抑制作用不如新鮮蕨菜液組。與腌制0.2g/mL組相比，其他3種處理方法均能抑制線蟲體內(nèi)CAT和SOD活力，腌制0.2g/mL線蟲體內(nèi)CAT、SOD活力分別為對照組的1.05、1.1倍，與新鮮1.0g/mL組、新鮮0.2g/mL組、腌制1.0g/mL組相比，腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)CAT活力分別提高了9.09%、13.41%、13.90%，SOD活力分別提高了31.82%、38.30%、37.66%?？傮w來說，蕨菜提取液對GSH-Px的抗氧化性抑制最為明顯，SOD次之，對CAT抑制作用微弱。

圖1 4種蕨菜提取液對線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力的影響注：設對照組為100%，其他組的值與對照組相比得到相對值。下同。與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；■與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；▲與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；■與▼相比，差異顯著(P<0.05)，?與◆相比，差異顯著(P<0.05)；與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；◆與空白組相比，差異顯著(P<0.05)

2.2 秀麗隱桿線蟲細胞體內(nèi)ROS含量分析

圖2 4種蕨菜提取液對線蟲體內(nèi)ROS含量的影響注：與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)；▲與空白組相比，差異顯著(P<0.05)；▲與相比，差異顯著(P<0.05)；●與相比，差異顯著(P<0.05)，■與●相比，差異顯著(P<0.05)

如圖2所示，與對照組相比，4組不同蕨菜提取液處理的線蟲體內(nèi)ROS含量均明顯升高，其中腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量顯著升高101.4%(P<0.01)，新鮮0.2g/mL組、新鮮1.0g/mL組、腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別升高了22.9%、34.5%、67.8%(P<0.05)；與新鮮1.0g/mL組相比，新鮮0.2g/mL組、腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別下降了44.9%、33.3%(P<0.05)，腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量升高33.6%(P<0.05)；與新鮮0.2g/mL組相比，新鮮1.0g/mL組、腌制0.2g/mL組、腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別升高了44.9%、78.5%、11.6%。以上結果說明，各蕨菜提取液使得線蟲體內(nèi)的ROS含量均顯著增加，腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量顯著增加。

2.3 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細胞凋亡的影響分析

由于DNA斷裂而增加的凋亡細胞經(jīng)吖啶橙染色處理后呈現(xiàn)黃色或橙色，正常細胞呈綠色，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到明顯的綠色正常細胞，綠光強度越來越弱即秀麗隱桿線蟲體內(nèi)正常細胞越來越少，凋亡細胞越來越多。與對照組相比，新鮮組和腌制組的綠光強度均弱于對照組，即對照組的綠光強度最強；對新鮮蕨菜組，圖3B-1的綠光強度強于圖3B-2；對腌制蕨菜組，圖3C-2的綠光強度強于圖3C-1；新鮮組與腌制組相比，圖3B-1的綠光強度強于圖3C-1，圖3C-2的綠光強度強于圖3B-2，而圖3B-1的綠光強度和圖3C-2的綠光強度、圖3B-2的綠光強度和圖3C-1的綠光強度無明顯差別。由此可知，蕨菜提取液對線蟲細胞有凋亡作用，對新鮮組其蕨菜提取液濃度升高，其綠光強度變?nèi)酰粚﹄缰平M其蕨菜提取液濃度升高，其綠光強度變強；新鮮1.0g/mL組和腌制 0.2g/mL對線蟲有明顯凋亡作用，新鮮0.2g/mL組和腌制 1.0g/mL對線蟲細胞的凋亡作用弱于前者。

圖3A(空白對照)

圖3B-1(新鮮0.2g/mL)

圖3B-2(新鮮1.0g/mL)

圖3C-1(腌制 0.2g/mL)

圖3C-2(腌制1.0g/mL)

3 討論

3.1 不同組分蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT三種抗氧化酶活力影響

3種氧化酶GSH-Px、SOD、CAT都是在抗氧化性方面極為重要的抗氧化劑，在清除自由基、延緩衰老、抗氧化、提高免疫力等方面有重要作用，可以在適當程度反映物質(zhì)對人體的健康影響。從本實驗結果來看，各組蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶活力存在抑制。先前研究顯示，蕨菜中含有類黃酮和多糖類物質(zhì)，類黃酮和多糖類物質(zhì)均有抗氧化作用，當多糖濃度為800μg/mL時的DPPH自由基清除率可達83.1%[21]。 但從3種酶的活性分析結果和ROS測定結果來說，線蟲體內(nèi)酶活性受到抑制并且其ROS含量明顯升高，蕨菜中此類物質(zhì)的作用并未見到效果。結合細胞凋亡的結果分析，蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶在清除自由基、發(fā)揮抗氧化酶活性方面表現(xiàn)出消極作用，即4種蕨菜提取液抑制抗氧化性的效果較明顯。從酶的抗氧化性角度分析，本實驗影響線蟲體內(nèi)酶抗氧化性的因素很多：一是內(nèi)在因素，蕨菜中本身含有抗氧化性物質(zhì)可促進抗氧化酶發(fā)揮作用，但結果表明酶活性受到抑制，說明蕨菜提取液中存在抑制酶活性的物質(zhì)，這種物質(zhì)或抑制了蕨菜中的抗氧化性物質(zhì)的表達或作用強于蕨菜中的抗氧化性物質(zhì)而使得酶活性最終受到抑制；二是外在因素，本實驗對蕨菜進行了腌制，腌制蕨菜中所含的亞硝酸鹽等具有氧化性，一定程度上對線蟲體內(nèi)的抗氧化酶造成影響。這兩方面也能解釋為何本實驗中腌制1.0g/mL組處理的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD、CAT的活性略高于對照組，可以對此做深入研究，從而更為準確地判定蕨菜提取液對這3種酶的作用機制和影響結果。

3.2 不同組分蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲細胞體內(nèi)ROS含量的影響

研究表明，ROS可通過細胞氧化應激反應而導致氧自由基及脂質(zhì)分解物等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生以及誘導細胞凋亡甚至導致其壞死，并且高濃度的ROS具有細胞毒作用，也會引起細胞凋亡、壞死[22]。本實驗中各組蕨菜提取液濃度處理的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量都比對照組高，其中腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量達到最高，新鮮1.0g/mL組次之，新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組含量又低于前兩組。通過細胞調(diào)亡試驗可以證明，各組蕨菜提取液濃度對線蟲細胞有明顯凋亡作用，且新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組的凋亡程度明顯低于另兩組，這與ROS含量測定結果對應，即ROS含量增加，對細胞有危害作用并誘導其凋亡甚至導致其壞死。再結合3種酶的活性分析，新鮮0.2g/mL組酶活抑制性弱于新鮮1.0g/mL組，且前者細胞ROS含量也低于后者；但對腌制組來說，雖然腌制0.2g/mL組酶活抑制性強于腌制1.0g/mL組且前者細胞ROS含量高于腌制1.0g/mL后者，但腌制0.2g/mL組酶活抑制性并非最強，其線蟲細胞的ROS含量卻為最高，從筆者上文對3種酶活性的分析討論看，是由于各種因素對酶活性的影響而造成的結果，具體的作用機制有待進一步試驗論證。但本實驗可以明確得出，蕨菜提取液對線蟲體內(nèi)細胞的ROS含量有明顯提高作用。

3.3 不同濃度蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲細胞凋亡的影響

由本實驗細胞凋亡結果可知，蕨菜提取液可以導致秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細胞發(fā)生非正常的機體凋亡。各組蕨菜提取液濃度處理的秀麗隱桿線蟲與對照組相比，其凋亡程度均大于對照組，其中新鮮0.2g/mL組的秀麗隱桿線蟲的凋亡程度低于新鮮1.0g/mL組；腌制0.2g/mL組的秀麗隱桿線蟲的凋亡程度低于腌制1.0g/mL組；對新鮮組來說，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的細胞凋亡程度與蕨菜水提取液濃度呈正相關，但對腌制組來說，則相反。從先前ROS含量測定結果來說，各組蕨菜提取液濃度處理的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量均明顯升高，且其細胞ROS含量的高低與細胞凋亡程度大致對應，可以測面證實線蟲細胞的凋亡。本實驗中難以判斷新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組凋亡程度的大小及新鮮1.0g/mL組和腌制0.2g/mL組凋亡程度的大??；從ROS含量測定結果來說，新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量分別小于新鮮1.0g/mL組和腌制0.2g/mL組線蟲體內(nèi)ROS含量，前兩者細胞內(nèi)自由基含量少于后兩者，相對而言對細胞造成的損傷稍小；結合3種抗氧化酶活性的測定結果來說，新鮮0.2g/mL組和腌制1.0g/mL組線蟲體內(nèi)3種抗氧化酶活性分別低于新鮮1.0g/mL組和腌制0.2g/mL組，這使得二者的作用相互碰撞或抑制，其機理尚未明確不能妄下斷論，可作為新的研究方向。言而總之，蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲的這種推動非正常細胞凋亡的作用，對秀麗隱桿線蟲本身而言是具有危害的。

4 結論

本文研究了不同蕨菜提取液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化特性的影響，結果顯示，不論是新鮮態(tài)蕨菜提取液還是腌制態(tài)蕨菜提取液都對秀麗隱桿線蟲抗氧化性和細胞凋亡機制有消極影響。但蕨菜提取液成分復雜，自由基及細胞凋亡的影響因素眾多，本文未能明確蕨菜影響抗氧化酶活和ROS的具體機理，后期可以做進一步的研究?！?/p>