蝦青素的毒理學(xué)安全性評價研究

石麗麗，韓 超，趙金鵬，李 巖

(中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，北京 100050)

蝦青素是一種在自然界中廣泛存在的天然抗氧化劑，其分子結(jié)構(gòu)中具有很長的共軛雙鍵鏈以及不飽和的酮基和羥基，能夠有效清除自由基和淬滅活性氧，使其具有較強的抗氧化活性[1]。研究表明，蝦青素還具有增強免疫力、抗炎抗感染、抑制腫瘤、降血糖、預(yù)防心血管疾病以及預(yù)防老年癡呆等多種有益作用[2-5]。因此，蝦青素在營養(yǎng)保健食品、食品添加劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等多個領(lǐng)域均具有廣闊的市場前景。本研究采用急性毒性試驗、遺傳毒性試驗、大鼠30d喂養(yǎng)試驗等毒理學(xué)評價方法，旨在對蝦青素的食用安全性進行評估，為蝦青素產(chǎn)品在保健食品和食品添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

受試物：蝦青素軟膠囊的內(nèi)容物為紅棕色油狀液體，人體推薦量為1g/d，即每天0.016 7g/kg·BW(成人按60kg體重計)。

1.2 實驗動物和飼料條件

SD大鼠(SPF級)、昆明種小鼠(SPF級)均購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。飼養(yǎng)地點為中國疾病預(yù)防控制中心動物房和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物房，許可證號為SYXK(京)2014-0043、SYXK(京)2013-0019，實驗室為屏障環(huán)境，溫度20～24℃，相對濕度40%～70%，實驗動物試驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3d。

1.3 試驗菌株

試驗菌株為鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102。

1.4 試驗方法

1.4.1急性經(jīng)口毒性試驗 健康SD大鼠20只，雌雄各半，體重180～220g，采用最大耐受量(MTD)法。實驗前動物隔夜空腹(禁食16h，不限制飲水)，以樣品原液直接灌胃給予動物，樣品的質(zhì)量體積比為0.950g/mL，以10.0mL/kg·BW灌胃量進行灌胃，灌胃2次，受試物給予劑量為19.0g/kg·BW。觀察期14d，記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

1.4.2Ames試驗 采用平板摻入法，使用鑒定合格的TA97、TA98、TA100、TA102菌株，S9混合液為體外代謝活化系統(tǒng)。稱取受試物1.0g，以0.103MPa、20min高壓滅菌后，加滅菌DMSO定容至20mL，濃度為5 000μg/皿，作為最高劑量組。試驗劑量為5 000、1 000、200、40、8μg/皿，另設(shè)空白對照組、溶劑對照組和陽性對照組，陽性物包括2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、1，8-二羥基蒽醌和敵克松，每個組別設(shè)3個平行皿。此試驗重復(fù)2次，若受試物的回變菌落數(shù)是溶劑對照組的2倍以上，且具有劑量反應(yīng)關(guān)系者則為陽性。

1.4.3小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 選用昆明小鼠50只，體重25～30g。實驗按照一次性最大灌胃劑量方法進行劑量設(shè)計，3個劑量組分別為2.38、4.75、9.50g/kg·BW，另設(shè)陰性對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg·BW)。采用間隔24h兩次經(jīng)口灌胃法進行試驗，按10mL/kg·BW灌胃，第二次給予受試物6h后頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓制片。每只小鼠計數(shù)200個嗜多染紅細胞(PCE)，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值(PCE/NCE)；并觀察1 000個PCE中含微核的細胞數(shù)，統(tǒng)計微核發(fā)生率。

1.4.4小鼠精子畸形試驗 選用健康性成熟雄性昆明小鼠30只，體重25～35g。按照一次性最大灌胃劑量方法進行劑量設(shè)計，3個受試物劑量組分別為2.38、4.75、9.50g/kg·BW，另設(shè)溶劑對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組(40mg/kg·BW)。灌胃量為10mL/kg·BW，連續(xù)5d給予受試物。實驗第35天，頸椎脫臼處死小鼠，取兩側(cè)附睪精子濾液制片、鏡檢。每只小鼠計數(shù)1 000個精子，并計算精子畸形率。

1.4.5大鼠30d喂養(yǎng)試驗 選用健康斷乳SD大鼠80只，設(shè)對照組和3個劑量組，每組20只，雌雄各半。根據(jù)樣品的人體推薦量設(shè)立3個劑量組，分別為0.418、0.835、1.670g/kg·BW，灌胃量為4mL/kg·BW。稱取41.75g受試物，食用植物油定容至100mL作為高劑量組，中、低劑量組依次以食用植物油2倍倍比稀釋，各劑量組終濃度分別為417.5、208.8、104.4mg/mL。對照組灌胃給予相同體積的食用植物油。試驗期間，每天觀察并記錄動物的生長狀況，每周稱2次體重，記錄每周進食量并計算食物利用率。30d后麻醉腹主動脈取血檢測血液學(xué)和血液生化學(xué)檢查。對每只動物進行大體解剖，肝、腎、脾和睪丸(卵巢)進行稱重，計算臟體比。對照組和高劑量組的肝、腎、脾、胃、十二指腸和睪丸(卵巢)進行組織病理學(xué)檢查。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，微核試驗采用泊松分布檢驗統(tǒng)計，精子畸形試驗采用卡方檢驗，大鼠30d喂養(yǎng)試驗采用方差分析，以α=0.05作為顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗

蝦青素以19.0g/kg·BW劑量灌胃給予大鼠，14d內(nèi)未見實驗動物出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況，表明蝦青素對雌、雄兩種性別的大鼠的急性毒性最大耐受劑量均大于19.0g/kg·BW，屬于無毒級。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Ames試驗在加S9與不加S9的情況下，各實驗組在相同實驗條件下重復(fù)2次，結(jié)果表明，蝦青素各劑量組的回變菌落數(shù)都未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量反應(yīng)關(guān)系。因此，蝦青素對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突變作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 與陰性對照組相比，蝦青素各劑量組嗜多染紅細胞(PCE)與成熟紅細胞(NCE)的百分比并未低于20%，說明在此實驗劑量下蝦青素未表現(xiàn)出細胞毒性。與陰性對照組相比，環(huán)磷酰胺陽性組的微核率顯著升高(P<0.01)，而各劑量組的微核率并未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果表明，蝦青素對小鼠骨髓嗜多染紅細胞未產(chǎn)生致突變作用(表1)。

表1 小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果

注：與陰性對照組相比，* *P<0.01

2.2.3小鼠精子畸形試驗 與陰性對照組相比，蝦青素各劑量組的精子畸形率無顯著性差異(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺陽性組與陰性對照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，說明蝦青素對小鼠精子無致畸作用(表2)。

表2 精子畸形試驗結(jié)果

注：與陰性對照組相比，* *P<0.01

2.3 大鼠30d喂養(yǎng)試驗

2.3.1生長狀況及食物利用率 實驗期間，各組動物活動正常，無明顯中毒癥狀，生長發(fā)育良好。與對照組相比，各劑量組動物體重、增重、進食量和食物利用率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 蝦青素軟膠囊對大鼠體重、食物總攝入量和食物利用率的影響

注：與對照組相比，P>0.05

2.3.2血液學(xué)指標 實驗?zāi)┢冢鲃┝拷M血液學(xué)指標與對照組比較，1.670g/kg·BW劑量組雌性大鼠單核細胞百分比明顯升高(P<0.05)，但此指標的差異在本實驗室對照組歷史正常檢測范圍內(nèi)，且劑量組之間無劑量反應(yīng)關(guān)系，因此上述差異無生物學(xué)意義，其余各劑量組血液學(xué)指標與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)(表4～5)。

表4 蝦青素軟膠囊對大鼠血液學(xué)的影響

注：與對照組相比，P>0.05

2.3.3血液生化指標 實驗?zāi)┢冢鲃┝拷M血液生化指標與對照組比較，0.418g/kg·BW劑量組雄性大鼠總蛋白含量顯著升高(P<0.05)，但此指標的變化在實驗室對照組歷史正常檢測范圍內(nèi)，該指標的升高無生物學(xué)意義。0.835g/kg·BW和1.670g/kg·BW劑量組雌性大鼠甘油三酯含量明顯低于對照組(P<0.05)，該指標的

降低無生物學(xué)意義。其余各劑量組血生化檢測結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表6～7)。

2.3.4對大鼠臟器重和臟體比的影響 各劑量組大鼠臟器重肝、脾、腎、睪丸(卵巢)及實驗?zāi)┛崭贵w重，臟體比肝/體、脾/體、腎/體、睪丸(卵巢)/體和陰性對照組比較均無顯著性差異。

2.3.5組織病理學(xué)檢查 對照組和高劑量組進行組織病理學(xué)檢查，個別動物的肝臟中發(fā)現(xiàn)輕度肝細胞脂肪變性(對照組4/20例、高劑量組4/20例)，小灶性炎細胞浸潤(對照組4/20例、高劑量組2/20例)，腎臟出現(xiàn)局灶性腎小管再生(對照組1/20例、高劑量組0/20例)、腎臟內(nèi)局灶性纖維組織增生及炎細胞浸潤(對照組1/20例、高劑量組0/20例)，以上肝臟和腎臟的病理學(xué)改變是動物常見自發(fā)病變，并且高劑量組的病變發(fā)生率與對照組無顯著性差異，因此該病變和受試物無關(guān)。其余臟器包括脾、胃及十二指腸、睪丸和卵巢未發(fā)現(xiàn)明顯異常。因此，與對照組比較，蝦青素并未引起動物肝、腎、脾、胃及十二指腸、睪丸(卵巢)的病理學(xué)改變。

表5 蝦青素軟膠囊對大鼠白細胞分類的影響

注：與對照組比較，*P<0.05

表6 蝦青素軟膠囊對大鼠血液生化指標的影響

注：與對照組比較，*P<0.05

3 討論

蝦青素廣泛存在于水生動物體中，人類日常食用的甲殼類和魚類等水產(chǎn)品中的蝦青素含量最高[6-7]。人類的日常食物中含有大量的蝦青素，攝入天然食物中的蝦青素是安全的，而對于提取濃縮和加工合成的蝦青素還有待進一步研究。近年來，人們對商品化的蝦青素產(chǎn)品的安全性也逐漸開展了相關(guān)的毒理學(xué)研究。劉敏等[8]研究蝦青素粉末制劑的急性毒性和遺傳毒性作用，結(jié)果表明，小鼠的經(jīng)口LD50>1g/kg·BW，蝦青素屬于無毒級，并未見遺傳毒性作用。曲見松等[9]對蝦青素軟膠囊(油溶制劑)的遺傳毒性進行研究，也未發(fā)現(xiàn)具有遺傳毒性。陳燕[10]對蝦青素相關(guān)的功能產(chǎn)品“蝦青素人參當歸茶葉軟膠囊”進行了安全性毒理學(xué)評價，該產(chǎn)品在急性毒性、遺傳毒性和30d喂養(yǎng)試驗中無明顯毒副作用。本實驗針對蝦青素軟膠囊開展毒性研究，結(jié)果表明，蝦青素軟膠囊對雌、雄大鼠的急性經(jīng)口最大耐受量(MTD)均大于19.0g/kg·BW。Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗和精子畸形試驗結(jié)果均未見該樣品有致突變作用。大鼠30d喂養(yǎng)試驗結(jié)果顯示，實驗動物活動正常，無明顯中毒癥狀，生長發(fā)育良好，各劑量組動物體重、進食量、食物利用率、血液學(xué)、血生化、臟器重量以及臟體比均未見異常，病理檢查也未見由受試物引起的異常改變。因此，在本實驗條件下蝦青素未見明顯毒副作用，為蝦青素作為保健食品的研究開發(fā)提供了重要的毒理學(xué)科學(xué)依據(jù)。◇

表7 蝦青素軟膠囊對大鼠血液生化指標的影響

注：與對照組比較，*P<0.05