不同種類滸苔多糖的體外抗菌活性研究

杜恒裔， 劉浩民， 鄒 玲， 李桂梅， 王述柏*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.山東海陽市畜牧獸醫(yī)局，山東海陽 265100）

畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗生素禁用已成大勢所趨，抗生素替代品的研發(fā)成為目前養(yǎng)殖行業(yè)亟待解決的課題。大量研究顯示，植物多糖類具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)動物免疫功能等作用。有研究表明，1%的茯苓多糖對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，0.05%的茯苓多糖對大腸桿菌有一定的抑制作用（安玉山等，2016）。3.2%香菇多糖 （純度為42.15%）對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定抑制作用（路志芳等，2017）。據(jù)報(bào)道，南非海洋巨藻水提多糖具有抑菌活性（Vlachos等，1997）。韓玲等（2013）研究發(fā)現(xiàn)腸滸苔提取物對部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有一定的抑制作用。高玉杰等（2013）研究硒化滸苔多糖和未經(jīng)硒化滸苔多糖的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制效果，硒化滸苔多糖的抑菌效果優(yōu)于未經(jīng)硒化滸苔多糖，且抑菌效果隨濃度增加而增強(qiáng)。本試驗(yàn)研究了自青島沿海生長的滸苔（Enteromorpha prolifera）提取物——一種以鼠李糖為主要成分的滸苔多糖（多糖含量為47.5%，以下稱為滸苔多糖1）及一種結(jié)構(gòu)上硒化的滸苔多糖（硒含量15%，多糖含量32%）的體外抑菌活性，旨在為其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 待檢材料 滸苔多糖1：經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測，其粗多糖（以鼠李糖計(jì)）含量為47.45%，粗多糖分子量600～6000 Da，粗蛋白質(zhì)含量為4.82%，含水量2.9%。

硒化滸苔多糖：對滸苔多糖1進(jìn)行硒化處理，其硒含量為15%，粗多糖（以鼠李糖計(jì)）含量32%。

上述兩種多糖均由青島海大生物公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)毒種 O157型大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌均來自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院菌種庫。

1.1.3 對照樣品 酵母細(xì)胞壁多糖 （25%β-葡聚糖和25%甘露糖）、黃芪多糖（純度45%）、45%硫酸黏桿菌素粉、林可霉素原粉。

1.2 試驗(yàn)方法 采用藥敏試驗(yàn)檢測滸苔多糖1、滸苔多糖硒對O157型大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈（胡桂學(xué)，2015）。

1.2.1 培養(yǎng)基的配置 瓊脂培養(yǎng)基：稱量瓊脂糖1.0 g、氯化鈉 8.0 g、苯酚 0.1 mL、蒸餾水 100 mL；先將瓊脂糖加到蒸餾水中，加熱融化后再加入氯化鈉、苯酚，最后用5.60%NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2。隨后放入121℃高壓鍋滅菌15 min，滅菌后倒瓊脂平板，冷凝備用。

LB肉湯培養(yǎng)基：稱取LB肉湯粉52 g溶于1000 mL蒸餾水，121℃高壓滅菌15 min冷卻后使用。

1.2.2 待檢樣品處理 不同濃度滸苔多糖粗提物、滸苔多糖硒溶液的配制：將粉劑的滸苔多糖粗提物、滸苔多糖硒分別用蒸餾水配制成10、20、50、100 mg/mL濃度的待測溶液。

林可霉素（粉劑）、硫酸黏桿菌素（粉劑）待測液的配制：分別用蒸餾水配制成50 μg/mL硫酸黏桿菌素，75 μg/mL林可霉素。

黃芪多糖、酵母細(xì)胞壁多糖待測液的配制：分別用蒸餾水配制成10、20、50、100 mg/mL待測溶液。

上述待測溶液除抗生素溶液外均采用高壓鍋在121℃溫度下滅菌15 min，冷卻待測。

1.2.3 含藥紙片的制備 將滅菌紙片用鑷子攤布于平皿中，以每張濾紙片飽和吸水量0.01 mL計(jì)，取10張濾紙片加入藥液0.1 mL，翻動濾紙片，使濾紙片將藥液均勻吸凈，浸泡30 min使藥敏片充分吸取藥液。然后將濾紙片放入滅菌平皿轉(zhuǎn)入37℃溫箱中烘干，烘烤時間4 h，抗生素藥敏片烘烤2 h。干燥后的藥敏片，放入滅菌窄口瓶中，貯藏于-20℃冰箱冰凍待用。使用前將濾紙片從冰箱取出室溫放置1 h后使用。

1.2.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 冷凍菌株室溫融化后，在超凈臺用接種環(huán)（酒精燈消毒后冷卻）取少量菌液采用四區(qū)畫線涂板法接種于配制好的瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，放入5 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)5 h，取100 μL滴于瓊脂培養(yǎng)基上，用玻璃涂布器涂勻，蓋好平皿，置室溫干燥5 min后，放置含有樣品的藥敏紙片。

1.2.5 抗菌活性檢測 用滅菌鑷子取出含藥紙片小心貼在涂有大腸桿菌菌液的瓊脂培養(yǎng)基表面。在直徑9 cm培養(yǎng)皿中，貼7張藥敏片，1張貼于中心，其余6張均勻貼于四周，距平皿邊緣1.5 cm。輕輕按壓貼片，確保藥敏紙片與瓊脂板之間無空隙。將平皿倒置放于37℃恒溫箱，培養(yǎng)24 h后觀察含藥紙片周圍有無抑菌環(huán)產(chǎn)生，量取抑菌圈直徑（包括紙片直徑）。對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抗菌活性檢測方法同大腸桿菌。

1.2.6 結(jié)果判定 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）抑菌活性判定使用標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈直徑（d）≤6 mm， 藥物敏感度判定為 -；6 mm＜d≤10 mm，藥物敏感度判定為+；d≤16 mm，藥物敏感度判定為++；d≤26 mm，藥物敏感度判定為+++；d＞26 mm，藥物敏感度判定為++++。藥物敏感度在++以上判定為具有抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 滸苔多糖粗提物的體外抑菌活性 由表1可看出，10～100 mg/mL濃度的滸苔多糖粗提物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未產(chǎn)生抑菌活性。林可霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性（++），硫酸黏桿菌素對大腸桿菌和沙門氏菌均有抑菌活性（++）。

表1 滸苔多糖粗提物的抑菌圈和抑菌活性

2.2 滸苔多糖硒的體外抑菌活性 由表2可知，50 mg/mL的滸苔多糖硒對金黃色葡萄球菌抑菌圈8 mm （+），100 mg/mL的滸苔多糖硒對金黃色葡萄球菌抑菌圈為18 mm（++），各濃度的滸苔多糖硒對大腸桿菌、沙門氏菌均無抗菌活性。林可霉素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性（++），硫酸黏桿菌素對大腸桿菌和沙門氏菌均有抑菌活性（++）。

表2 滸苔多糖硒的抑菌圈和抑菌活性

3 討論

3.1 滸苔多糖粗提物的體外抗菌活性 對于滸苔多糖的抗菌活性國內(nèi)外報(bào)道較少。Rizvi等（2000）對巴基斯坦海岸的26種藻類進(jìn)行抗菌活性篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸滸苔對多種真菌具有抑制活性。Mehrtens（1994）研究發(fā)現(xiàn)，扁滸苔具有抑菌活性，其機(jī)理可能與其碘代過氧化物酶活性高有關(guān)。高玉杰（2013）報(bào)道，滸苔多糖濃度為6.80 mg/mL時，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長被完全抑制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，10～100 mg/mL濃度的滸苔多糖粗提物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未產(chǎn)生抑菌作用，與高玉杰的研究結(jié)果不一致，其原因可能與本試驗(yàn)所用樣品滸苔多糖的含量低（47.45%）有關(guān)。

3.2 滸苔多糖硒的體外抗菌活性 據(jù)報(bào)道，硒具有清除自由基、提高動物免疫能力等作用，硒多糖具有硒與多糖的雙重功效，在抗氧化、抗腫瘤等方面具有獨(dú)特的生物活性（高玉杰等，2012）。另據(jù)報(bào)道，硒含量為512.3 μg/g的硒化滸苔多糖濃度為1.70 mg/mL時，可完全抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長（路則慶，2014）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，滸苔多糖硒濃度為100 mg/mL時對金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，對大腸桿菌和沙門氏菌無抑菌作用。本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道的不一致，可能與樣品的純度太低有關(guān)。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，滸苔多糖粗提物濃度為10～100 mg/mL時對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未產(chǎn)生抑菌作用，滸苔多糖硒濃度為100 mg/mL時對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，對大腸桿菌和沙門氏菌無抑菌作用。