一種優(yōu)化的豬卵泡顆粒細(xì)胞分離方法及驗(yàn)證

曲小露 施振旦 李輝

摘要：目前，進(jìn)行體外研究的卵泡顆粒細(xì)胞主要通過(guò)抽取卵泡液的方式獲得。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)該方式獲得的顆粒細(xì)胞貼壁率低且活力差。為解決該問(wèn)題，在抽取方式的基礎(chǔ)上采用FICOLL-Paque分離液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步純化，并通過(guò)CCK-8、Western Blot、免疫熒光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分別對(duì)純化細(xì)胞的形態(tài)、增殖能力、激素分泌相關(guān)受體（FSHR、LHCGR）和基因（CYP19A1、CYP11A1、StAR）的表達(dá)及激素分泌情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)純化的細(xì)胞貼壁能力、細(xì)胞形態(tài)和增殖能力明顯改善，且各激素分泌相關(guān)基因都有表達(dá);E2分泌量明顯提高，而P4分泌明顯降低。研究結(jié)果表明，經(jīng)FICOLL-Paque分離液純化后的豬卵泡顆粒細(xì)胞中黃體化的顆粒細(xì)胞被大部分清除，純化后的細(xì)胞活力更好且更能體現(xiàn)出顆粒細(xì)胞的特性。

關(guān)鍵詞：顆粒細(xì)胞;FICOLL-Paque;細(xì)胞增殖;孕酮;免疫熒光染色;FSH受體

中圖分類號(hào)： S828.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0190-05

顆粒細(xì)胞存在于卵泡中，處于膜細(xì)胞與卵子之間，具有將膜細(xì)胞所合成的雄激素轉(zhuǎn)化成維持卵子發(fā)育和發(fā)情所必需的雌激素的功能，同時(shí)組成了維持卵子發(fā)育的良好微環(huán)境[1-3]，并且可通過(guò)微絨毛為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持。因此，顆粒細(xì)胞功能不良將直接影響卵子的發(fā)育潛能，并必將抑制動(dòng)物的繁殖性能。前人研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞的凋亡可導(dǎo)致卵泡閉鎖[4]，而其功能受損將抑制其雌激素的分泌[5]。因此顆粒細(xì)胞是研究卵泡發(fā)育及內(nèi)分泌的重要細(xì)胞模型。

目前，科研中用到的顆粒細(xì)胞普遍采用體外分離培養(yǎng)的方式獲得[6]，而體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)將直接影響后續(xù)試驗(yàn)及其結(jié)果的可靠性。因此，獲得活力好的豬顆粒細(xì)胞對(duì)研究豬繁殖內(nèi)分泌的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。顆粒細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法目前主要有剖切刮取和針頭抽吸分離2種，而后者的應(yīng)用更為普遍，該方法操作簡(jiǎn)便，主要通過(guò)短時(shí)間沉淀，棄去大的細(xì)胞團(tuán)塊、組織塊和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，簡(jiǎn)稱COC）后，經(jīng)離心-清洗等步驟獲得相對(duì)純凈的顆粒細(xì)胞。閆益波等研究發(fā)現(xiàn)，剖切法和抽吸法分離豬卵巢顆粒細(xì)胞的方式各有優(yōu)劣，其中抽吸法能夠更快速獲得豬顆粒細(xì)胞[7]。除上述方法外，也有研究者通過(guò)FICOLL-Paque分離液進(jìn)行了人顆粒細(xì)胞的分離并進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)檢測(cè)，如Chilvers等在2012年用PERCOLL和FICOLL-Paque分離液分別進(jìn)行了人顆粒細(xì)胞的分離，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)采用FICOLL-Paque分離液分離的顆粒細(xì)胞純度好于PERCOLL[8]。目前，尚未有采用FICOLL-Paque分離液對(duì)豬顆粒細(xì)胞進(jìn)行分離純化的相關(guān)報(bào)道。

在前期大量試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然抽吸法可以快速獲得大量顆粒細(xì)胞，但是獲得的細(xì)胞性能不穩(wěn)定，主要表現(xiàn)在細(xì)胞貼壁數(shù)量少、活力差等方面。為解決該問(wèn)題，本試驗(yàn)擬在抽吸法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用FICOLL-Paque分離液以密度梯度離心的方式對(duì)通過(guò)抽吸卵泡液獲得的細(xì)胞進(jìn)行純化，旨在獲得更加純凈、活力更好的豬卵泡顆粒細(xì)胞，為后續(xù)的試驗(yàn)開(kāi)展提供更好的細(xì)胞模型。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2018年5—7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所動(dòng)物品種改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

豬卵巢取自江蘇省南京市當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)180日齡左右的健康商品母豬。收集卵泡發(fā)育好的卵巢，置于37 ℃盛有含2%青鏈霉素的生理鹽水的保溫杯中，于2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

FICOLL-Paque分離液購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫法測(cè)雌二醇、孕酮檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，青鏈霉素、DNA提取試劑盒、0.25%無(wú)EDTA胰酶購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑、FITC標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，抗FSHR和抗LHCGR抗體購(gòu)自愛(ài)必信（上海）生物科技有限公司，CCK-8、蛋白裂解液、BCA法測(cè)蛋白、羊抗兔HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM/F12、PBS購(gòu)自南京維森特生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購(gòu)自Gibico。陰性對(duì)照細(xì)胞3D4/21豬肺泡巨噬細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬卵泡顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 用37 ℃無(wú)菌生理鹽水沖洗卵巢3～4次后，用滅菌紗布拭干卵巢表面水分，選取直徑為3～6 mm 的卵泡，用10 mL注射器配10號(hào)針頭抽取卵泡液（注意避開(kāi)血管）。

傳統(tǒng)分離方法：將上述操作收集的卵泡液在 37 ℃ 條件下水浴靜置5 min，收集上清分裝到15 mL離心管中，于 1 200 r/min 離心機(jī)中離心2 min。棄掉上清，將收集到的細(xì)胞用PBS重懸清洗2～3次，用含10% FBS，2%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，并置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)。

FICOLL-Paque分離方法：將收集的卵泡液裝入15 mL離心管中，在37 ℃條件下水浴靜置15 min，棄上清后，于 1 200 r/min 離心機(jī)中離心2 min。棄掉上清，將沉淀重懸后轉(zhuǎn)移至裝有FICOLL-Paque分離液中的15 mL離心管中（輕輕沿管壁滴加至FICOLL-Paque分離液上層，注意不要打破液面）。輕輕轉(zhuǎn)移至水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)中，在4 000 r/min下離心 30 min。待細(xì)胞分層后，將中層懸浮層細(xì)胞吸出轉(zhuǎn)移至新的15 mL無(wú)菌離心管中，于1 200 r/min下離心2 min，去除FICOLL-Paque分離液后，加入不含EDTA的0.25%胰酶消化2 min，使細(xì)胞團(tuán)分散成單個(gè)細(xì)胞。用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，然后在1 200 r/min下離心5 min，將收集的細(xì)胞用PBS清洗2～3次后，用含10% FBS、2%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，并置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)。

2.3 與激素分泌相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

顆粒細(xì)胞是激素分泌的關(guān)鍵細(xì)胞。在卵泡期，膜細(xì)胞合成的雄激素主要在FSH作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?，在此過(guò)程中FSHR和CYP19A1發(fā)揮重要作用。LH峰后排卵，同時(shí)顆粒細(xì)胞開(kāi)始黃體化，逐步減少雌激素分泌，轉(zhuǎn)而分泌孕酮。在此期間，LHCGR接受到LH的信號(hào)后，將合成孕酮的原料膽固醇在StAR的協(xié)助下從線粒體外膜轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，并在CYP11A1和HSD-3β的作用下加工成孕酮。因此，為滿足孕酮的分泌，顆粒細(xì)胞必須表達(dá)LHCGR、StAR和CYP11A1等基因。此外，顆粒細(xì)胞又分為壁顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。因卵丘細(xì)胞不表達(dá)LHCGR，不能接受LH的信號(hào)[11]，所以，在體外試驗(yàn)中常做區(qū)分。在本研究中，為檢測(cè)所分離的細(xì)胞的確是壁顆粒細(xì)胞，對(duì)FSHR、LHCGR、StAR、CYP19A1、CYP11A1基因進(jìn)行了檢測(cè)。從圖3-A可以看出，采用FICOLL-Paque方法和傳統(tǒng)方法分離的細(xì)胞均表達(dá)了上述各基因（CT值均在30以下），而作為空白對(duì)照的豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21中各基因擴(kuò)增的CT值均在34以上，可視為不表達(dá)。同時(shí)對(duì)采用傳統(tǒng)方法和FICOLL-Paque方法分離的顆粒細(xì)胞中上述各基因的表達(dá)進(jìn)行了電泳分析（圖3-B）。為證明所分離的細(xì)胞在蛋白水平上表達(dá)了FSHR，采取免疫熒光染色的方法對(duì)FSHR在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法所分離的細(xì)胞均表達(dá)了FSHR（圖3-C）。另外進(jìn)一步通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)與激素分泌相關(guān)的基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21，F(xiàn)ICOLL-Paque方法分離的顆粒細(xì)胞在蛋白水平全部表達(dá)（圖3-D）。

2.5 雌激素和孕酮分泌的檢測(cè)

顆粒細(xì)胞的最主要功能是激素的分泌。卵泡期顆粒細(xì)胞主要分泌雌激素，而黃體化的顆粒細(xì)胞停止雌激素分泌，轉(zhuǎn)而分泌孕酮。因此，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素和孕酮的分泌水平來(lái)判定細(xì)胞的狀態(tài)。本研究采用ELISA分析了2種分離方法所分離的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h內(nèi)的激素累積量，并通過(guò)DNA的量進(jìn)行均一化處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用FICOLL-Paque法分離的細(xì)胞單位雌二醇分泌量高于傳統(tǒng)方法;相反孕酮的分泌量明顯低于傳統(tǒng)方法（圖4）。從該結(jié)果可以看出，傳統(tǒng)方法分離的顆粒細(xì)胞中含有部分已經(jīng)黃體化的細(xì)胞，而經(jīng)FICOLL-Paque方法純化后，可明顯清除該部分細(xì)胞。

3 討論

顆粒細(xì)胞是研究卵巢類固醇激素生成和卵泡發(fā)育時(shí)最常用的一種細(xì)胞，在雌二醇、孕酮的生成和卵子的發(fā)育中起到重

要作用。隨著卵泡的發(fā)育，顆粒細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變[12]。鄰近排卵期時(shí)，顆粒細(xì)胞會(huì)慢慢黃體化，大量分泌孕酮，停止或者少量分泌雌二醇[13-14]。為了研究與顆粒細(xì)胞雌二醇分泌相關(guān)的調(diào)控機(jī)制， 需用到雌二醇分泌高峰期的顆粒細(xì)胞，然而在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)分離方法獲得的細(xì)胞并不能滿足試驗(yàn)的需求。因此需要優(yōu)化分離方法，為顆粒細(xì)胞的體外研究提供更好的細(xì)胞模型。

本研究在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上，采用FICOLL-Paque分離液進(jìn)一步純化的方式分離豬卵泡顆粒細(xì)胞。FICOLL-Paque分離液是高分子量蔗糖聚合物和泛影酸鈉混合溶液，作為密度梯度介質(zhì)可通過(guò)簡(jiǎn)單快速離心程序從血液中有效提取高純度的活單核細(xì)胞，此前已有多篇成功分離單核巨噬細(xì)胞的報(bào)道[15-17]，有關(guān)學(xué)者嘗試用其分離人顆粒細(xì)胞[18-19]，并取得了較好的效果。本研究率先將該方法應(yīng)用于豬顆粒細(xì)胞的分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)該方法分離的細(xì)胞不但貼壁率大大提高，而且細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)于傳統(tǒng)方法。另外，進(jìn)一步采用CCK-8方法對(duì)細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FICOLL-Paque分離液純化過(guò)的細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于普通方法所分離的細(xì)胞。雖然都表達(dá)了與激素分泌相關(guān)的基因，但是進(jìn)一步的激素測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)FICOLL-Paque分離液純化過(guò)的細(xì)胞單位孕酮分泌量明顯低于傳統(tǒng)方法分離的細(xì)胞，但是雌激素的分泌量卻相反。因此該結(jié)果從側(cè)面證實(shí)有些豬卵巢顆粒細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始黃體化，而經(jīng)FICOLL-Paque分離后可清除該部分細(xì)胞。相關(guān)報(bào)道認(rèn)為，在抽吸的卵泡液中殘留有一定數(shù)量的紅細(xì)胞和白細(xì)胞[9-10]。因此，除了細(xì)胞自身黃體化的原因外，卵泡液中的殘留物也可能是影響所分離的顆粒細(xì)胞狀態(tài)和活力的重要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)分離方法所獲得的細(xì)胞多為單細(xì)胞，而其中貼壁好且活力好的細(xì)胞多為細(xì)胞團(tuán);相反經(jīng)FICOLL-Paque方法分離的細(xì)胞中細(xì)胞團(tuán)居多，這也是在實(shí)際操作中進(jìn)行胰酶消化的原因。這種現(xiàn)象提示，卵泡中顆粒細(xì)胞功能的維持可能需要細(xì)胞間的互作和連接。黃明宇等認(rèn)為，細(xì)胞間互作可以控制細(xì)胞存活、凋亡、遷移、增殖和分化等基本細(xì)胞功能[20]，而細(xì)胞間互作可通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，簡(jiǎn)稱ECM）以及旁分泌、自分泌和直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸實(shí)現(xiàn)[21]。直接的細(xì)胞間接觸是由間隙連接、小蛋白質(zhì)隧道組成[22]。間隙連接通信是細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞通信的重要組成部分，它由連接蛋白、小質(zhì)膜蛋白組成，它們形成蛋白質(zhì)隧道，形成連接2個(gè)相鄰細(xì)胞的間隙連接[23]。前人研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞在卵泡期的信號(hào)和物質(zhì)共享需要胞間連接分子CX43的參與，而黃體化后ECM可發(fā)生重構(gòu)，同時(shí)胞間連接也會(huì)削弱[24-25]。本試驗(yàn)通過(guò)FICOLL-Paque方法分離的細(xì)胞多以細(xì)胞團(tuán)的形式存在，該現(xiàn)象也恰好說(shuō)明分離的細(xì)胞間互作強(qiáng);而傳統(tǒng)方法獲得的細(xì)胞多以單細(xì)胞形式存在，說(shuō)明通過(guò)這種方式分離的細(xì)胞，由于接近黃體化，而導(dǎo)致細(xì)胞間的互作差。然而目前產(chǎn)生此種現(xiàn)象的分子機(jī)制尚未明晰，還需今后進(jìn)一步開(kāi)展這方面的研究。

本研究在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上，采用FICOLL-Paque分離液成功分離到了較純的豬卵泡顆粒細(xì)胞，并通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步證明了通過(guò)該方法分離的細(xì)胞貼壁率、增殖能力要優(yōu)于傳統(tǒng)方法，為今后的試驗(yàn)提供了較好的細(xì)胞模型。

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收稿日期：2018-08-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31402080）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20151365）。

作者簡(jiǎn)介：曲小露（1993—），男，山東東營(yíng)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物繁殖方面研究。E-mail：qquuxxiiaaoolluu@163.com。

通信作者：李 輝，博士，副研究員，主要從事動(dòng)物繁殖方面研究。E-mail：lhlydk@126.com。