牛磺熊去氧膽酸預(yù)防高脂飲食小鼠膽囊結(jié)石的研究

陸啟帆， 蔣兆彥， 王啟晗， 趙 剛， 胡 海

（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院膽石病中心，上海 200120）

膽石病是全世界常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病之一,近年來(lái)發(fā)病率逐年上升。膽結(jié)石按種類(lèi)可分為膽固醇結(jié)石、膽色素結(jié)石及混合性結(jié)石。超過(guò)90%的膽結(jié)石由膽固醇組成,并在膽囊內(nèi)形成。有研究表明高脂飲食可影響小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，而腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變則會(huì)影響小鼠血清及肝臟的脂質(zhì)含量［1］。?；切苋パ跄懰?(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)作為一種膽石病治療藥物，可有效降低膽囊膽汁的膽固醇含量，降低膽囊結(jié)石的成石率［2］，并增加膽囊膽汁中的膽汁酸含量，防止膽囊膽固醇結(jié)石的形成。關(guān)于TUDCA降低膽囊結(jié)石成石率，多數(shù)文獻(xiàn)指出，是增加膽汁酸量，改變肝臟膽固醇代謝所致。本研究通過(guò)體視鏡觀察，腸道菌群結(jié)構(gòu)分析及定量實(shí)時(shí)聚合酶聯(lián)反應(yīng) (quantitative real time polymerase chain reaction，q-PCR)等方法，檢測(cè)小鼠的膽囊結(jié)石形成情況，腸道菌群結(jié)構(gòu)變化,及肝臟、腸道中脂質(zhì)和膽汁酸代謝相關(guān)基因的變化，以探討TUDCA通過(guò)改變高脂飲食小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到降低成石率的目的。

材料與方法

一、材料

健康雄性SPF級(jí)c57bl/6小鼠30只，4周齡，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。ABI Q6 Flex熒光q-PCR系統(tǒng)，Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自ThermoFisher Scientific(批號(hào)176407)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ThermoFisher Scientific(批號(hào)00634069)，膽固醇檢測(cè)試劑盒購(gòu)Roche Diagnostics GmbH(批號(hào)31851101)，三酰甘油檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche Diagnostics GmbH(批號(hào)34174001)，磷脂檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation(批號(hào)AQQ6933)，膽汁酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Randox Laboratories Ltd(批號(hào) 416850)。

二、方法

(一)動(dòng)物模型制備

小鼠普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組：給予成石飼料(lithogenic diet，LD)(普通飼料98.25%+1.25%膽固醇+0.5%膽鹽)，為L(zhǎng)D組(15只)；給予預(yù)先配比混有TUDCA的飼料 (TUDCA 5 g/kg LD)，為T(mén)UDCA組(15只)。每只籠內(nèi)飼養(yǎng)5只。動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)(光照和黑暗各12 h，21℃～24℃，濕度 50%～55%)。每天每籠給予20 g飼料，喂養(yǎng)8周。

(二)組織樣本采集

喂養(yǎng)8周后，使用4%水合氯醛麻醉。摘取眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，固定于取樣臺(tái)。取膽囊、肝臟、小腸，放入凍存管液氮凍存，-80℃冰箱保存。

(三)總 RNA提取

取50 mg肝臟及小腸組織置于凍存管中，加入500μL Trizol液，徹底勻漿后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μL Trizol液及200μL氯仿，劇烈震蕩混勻后4℃離心，12 000轉(zhuǎn)/min，5 min，將離心后的上層水相轉(zhuǎn)入新離心管中，加入500μL異丙醇并混勻后，4℃離心，12 000轉(zhuǎn)/min，10 min，棄去上清液，用無(wú)水乙醇及DEPC水配成的75%乙醇1 mL洗滌沉淀，用DEPC水溶解沉淀并調(diào)整濃度至200 mg/L即為用于逆轉(zhuǎn)錄的總RNA。

(四)q-PCR檢測(cè)

應(yīng)用q-PCR法，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)兩組小鼠肝臟 Abcg5、Abcg8、Abcb11、Acat2、Cyp27、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα,TNF-α)及小腸 Hmgcr、Npc1L1、Fgf15(中英文全稱(chēng)見(jiàn)后)mRNA表達(dá)水平。將提取得到的總RNA取2μg按照Thermo Fisher逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。所有檢測(cè)基因的引物序列見(jiàn)表1。

(五)腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

收集第8周小鼠的糞便共計(jì)30份，提取其中微生物總DNA。針對(duì)16 SrDNA基因V4區(qū)合成特有引物，行PCR擴(kuò)增并完成文庫(kù)構(gòu)建。在MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序與分析。

(六)肝臟脂質(zhì)提取和測(cè)定

取50 mg小鼠肝臟，切碎后置于試管。每管加入3 mL Folch液(三氯甲烷∶甲醇=2∶1)4℃過(guò)夜。然后轉(zhuǎn)移至新試管，另加1 mL Folch液淋洗。將1 mL淋洗液再加入。按照檢測(cè)種類(lèi)不同，吸取不同量液體(總膽固醇100μL，三酰甘油50μL)至新試管中，57℃恒溫干燥。按照膽固醇及三酰甘油檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

(七)膽汁酸檢測(cè)

取膽囊膽汁，滴入干凈的離心管中。膽汁經(jīng)甲醇稀釋后，分別使用膽汁酸檢測(cè)試劑盒以及磷脂檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。膽囊膽汁膽固醇飽和指數(shù)則通過(guò)Carey表計(jì)算得出。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、成石率及肝臟病理改變結(jié)果

在體視鏡下觀察可知，LD組小鼠膽囊中均可見(jiàn)圓潤(rùn)成型的膽固醇結(jié)石同時(shí)伴有大量的膽固醇結(jié)晶(見(jiàn)圖 1A、B)，成石率 100%。TUDCA組小鼠膽囊則呈現(xiàn)為清澈透亮狀(見(jiàn)圖2A、B)，并未發(fā)現(xiàn)有成型的膽固醇結(jié)石，僅在其中3只小鼠膽囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量散在結(jié)晶(見(jiàn)表2)。HE染色的小鼠肝臟病理切片，發(fā)現(xiàn)LD組肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪變形(見(jiàn)圖3)，而TUDCA組肝臟細(xì)胞形態(tài)良好(見(jiàn)圖4)。

表2 小鼠膽囊大體情況

二、肝臟與血清脂質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步分析TUDCA對(duì)于膽固醇代謝的影響，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩組小鼠肝臟以及血清的脂質(zhì)含量(見(jiàn)圖5A、表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與LD組相比，TUDCA組小鼠血清的總膽固醇、高密度脂蛋白(high-density lipoproteins,HDL)膽固醇及低密度脂蛋白(lowdensity lipoproteins,LDL)膽固醇含量均顯著下降(P＜0.01)。同時(shí)兩組小鼠肝臟的脂質(zhì)含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與LD組相比，TUDCA組肝臟的三酰甘油及膽固醇含量顯著下降(P＜0.01)(見(jiàn)圖5B、表4)。

圖1 LD喂養(yǎng)小鼠8周后的肝臟及膽囊

圖2 LD+TUDCA喂養(yǎng)小鼠8周后的肝臟及膽囊

表3 血清脂質(zhì)含量檢測(cè)（mmol/L）

表4 肝臟脂質(zhì)檢測(cè)（mg/g）

表1 相關(guān)指標(biāo)引物序列

圖3 LD喂養(yǎng)小鼠8周后的肝臟病理切片（HE，×20）

圖4 LD+TUDCA喂養(yǎng)小鼠8周后的肝臟病理切片（HE，×20）

三、TUDCA治療后小鼠腸道菌群的變化

圖5 肝臟及血清脂質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物的菌群測(cè)序顯示，TUDCA組腸道厚壁菌門(mén)豐度較LD組增加，而擬桿菌門(mén)豐度則降低(見(jiàn)圖6A、B、C)，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值上升3.13倍(見(jiàn)圖6D)，兩組腸道菌群比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 腸道菌群

四、小腸脂質(zhì)及膽汁酸代謝相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果

與小腸膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)的關(guān)鍵蛋白Npc1L1(Niemann piok typec1 like1)、ATP 結(jié)合盒 G5(ATPbinding cassette,Abcg5)和G8(ATP binding cassette,Abcg8)基因的mRNA表達(dá)量在兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。但與LD組比較，TUDCA組的小腸中3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A reductase,Hmgcr)的表達(dá)下降(P＜0.05)(見(jiàn)表 6、圖7A)。 此外，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15(fibroblast growth factor 15,Fgf15)表達(dá)在TUDCA組顯著上升(P＜0.001)(見(jiàn)表6、圖 7B)。

五、肝臟脂質(zhì)及膽汁酸代謝相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果

與LD組比較，TUDCA組肝臟Abcg5及Abcg8基因表達(dá)量均有所下降，同時(shí)TUDCA組肝臟的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因Abcb11(ATP binding cassette subfamily B member 11)表達(dá)量則顯著上升。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，TUDCA組肝臟的乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶2(acetyl-coenzyme A acetyltransferase 2,Acat2)表達(dá)量也有所上升。與LD組相比，TUDCA組肝臟的膽汁酸合成限速酶Cyp27(sterol 27-hydroxylase)的表達(dá)量也明顯上升。兩組比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖 8A、表 7)。與 LD 組比較，TUDCA 組肝臟TNF-α表達(dá)量顯著下降(見(jiàn)圖8B)。

表6 小腸組織q-PCR檢測(cè)結(jié)果

六、兩組小鼠膽囊膽汁成分測(cè)定

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組小鼠的膽囊膽汁成分發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖9)。與LD組相比，TUDCA組小鼠膽囊膽汁內(nèi)的膽固醇、磷脂、總脂質(zhì)含量及膽固醇飽和指數(shù)均明顯下降，同時(shí)膽囊膽汁內(nèi)的膽汁酸含量則明顯上升。兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表8)。

討 論

一、TUDCA降低膽囊結(jié)石的發(fā)生率

圖8 小鼠肝臟膽固醇及膽汁酸代謝相關(guān)基因檢測(cè)

圖9 小鼠膽囊膽汁成分測(cè)定

表8 膽囊膽汁成分檢測(cè)結(jié)果

膽囊膽固醇結(jié)石的形成與膽囊膽汁膽固醇過(guò)飽和導(dǎo)致的膽固醇析出形成膽固醇結(jié)晶有關(guān)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，TUDCA可顯著預(yù)防小鼠膽囊膽固醇結(jié)石的形成，僅3只小鼠見(jiàn)膽囊膽汁內(nèi)膽固醇結(jié)晶。這與使用TUDCA后降低膽囊膽汁膽固醇飽和指數(shù)有關(guān)。在臨床上，TUDCA治療也具有明顯降低體內(nèi)膽固醇含量的作用［4］。本研究結(jié)果顯示，TUDCA治療后小鼠血清及肝臟膽固醇含量均顯著降低，且肝臟脂肪浸潤(rùn)明顯改善，表明TUDCA具有降低高膽固醇飼料喂養(yǎng)小鼠整體的膽固醇含量效應(yīng)。

二、TUDCA影響體內(nèi)膽固醇代謝

膽汁酸是膽汁的主要成分之一，是具備親水性和疏水性的兩性分子，按照特性不同可分為親水性膽汁酸及疏水性膽汁酸。親水性膽汁酸可穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，拮抗疏水性膽汁酸的細(xì)胞毒性作用。TUDCA作為親水性膽汁酸的代表，具有降低小腸膽固醇吸收的效應(yīng)［5］，進(jìn)而減少機(jī)體對(duì)飲食膽固醇的攝取，降低膽固醇負(fù)荷。 此外，Mueller等［6］研究發(fā)現(xiàn)短期使用UDCA尚可促進(jìn)膽汁酸合成和膽固醇轉(zhuǎn)化。本研究顯示，膽汁酸合成關(guān)鍵酶Cyp27表達(dá)上升，可能反映TUDCA治療后對(duì)膽汁酸合成的促進(jìn)效應(yīng)。Abcg5和Abcg8是肝臟膽小管側(cè)膜分泌膽汁膽固醇的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。筆者發(fā)現(xiàn)TUDCA治療后顯著降低Abcg5和Abcg8在小鼠肝臟的表達(dá)，因而對(duì)于降低肝細(xì)胞向膽汁分泌膽固醇，降低膽汁膽固醇飽和指數(shù)有重要作用，與TUDCA組膽結(jié)石形成的減少密切相關(guān)。

三、TUDCA通過(guò)改變腸道菌群豐度與分布降低成石率

小腸作為吸收和合成膽固醇的場(chǎng)所之一，高膽固醇飲食將會(huì)影響腸道菌群的豐度與分布，進(jìn)而導(dǎo)致腸道對(duì)于脂質(zhì)的吸收增加及全身肥胖［7］。有文獻(xiàn)指出膽結(jié)石病人腸道菌群結(jié)構(gòu)與正常人顯著不同，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)會(huì)增加膽囊結(jié)石患病的易感性［8-9］。改善腸道菌群結(jié)構(gòu)則有助于肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸及抑制血清及肝臟內(nèi)膽固醇積聚，并進(jìn)一步降低膽囊膽汁膽固醇含量。Hildebrandt等［10］研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠高脂飼料即高膽固醇、無(wú)膽酸飼料喂養(yǎng)時(shí)，小鼠腸道內(nèi)變形菌門(mén)數(shù)量上升。筆者團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠成石飼料即含有高膽固醇、低濃度膽酸飼料喂養(yǎng)時(shí)，與普通飼料相比，小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值下降、膽囊結(jié)石形成［11］。Islam等［12］通過(guò)給予大鼠含高濃度膽酸(2 g膽酸/kg飼料)的飼料10 d后發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)占比增加而擬桿菌門(mén)占比減少。筆者給予小鼠飼料(5 gTUDCA/kg LD)后，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)中厚壁菌門(mén)豐度占比上升，而擬桿菌門(mén)豐度占比下降，TUDCA組厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比是成石組的3.13倍。筆者認(rèn)為造成高脂飼料、高脂+低濃度膽汁酸飼料及高脂+高濃度膽汁酸飼料之間腸道菌群結(jié)構(gòu)差異的原因可能是，膽汁酸對(duì)于腸道細(xì)菌具有強(qiáng)烈的選擇性，高濃度膽汁酸抑制了腸道中部分不耐受膽汁酸的細(xì)菌增殖。Wang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熊去氧膽酸處理后，高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠血清及肝臟脂質(zhì)含量明顯下降。本研究發(fā)現(xiàn)，TUDCA處理后的小鼠血清及肝臟脂質(zhì)含量也明顯下降，同時(shí)，小鼠腸道內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Npc1L1、Abcg5、Abcg8基因的 mRNA表達(dá)量在兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明TUDCA減少血清以及肝臟脂質(zhì)含量的方式并不是通過(guò)抑制小腸膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。Degirolamo等［14］研究發(fā)現(xiàn)，腸道中厚壁菌門(mén)數(shù)量的上升可通過(guò)上調(diào)Cyp7及Cyp27的表達(dá)來(lái)增加肝臟膽汁酸的合成。Jia等［15］研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群數(shù)量上升產(chǎn)生大量膽汁酸水解酶，在腸道內(nèi)將結(jié)合膽汁酸水解為大量次級(jí)膽汁酸：石膽酸(lithocholic acid,LCA)及脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)，而G蛋白膽汁酸偶聯(lián)受體5則受LCA及DCA的激活抑制肝臟膽汁酸的合成。Juste［16］研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)的膽汁酸水解酶主要由擬桿菌門(mén)細(xì)菌產(chǎn)生，而本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TUDCA處理后，腸道擬桿菌門(mén)占比由LD組中的25.70%顯著下降至TUDCA組中的10.67%。 Hu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LD飼料中高水平膽固醇含量可顯著增加腸壁通透性，導(dǎo)致細(xì)菌脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)過(guò)量入血，從而導(dǎo)致TNF-α表達(dá)上升、膽固醇積聚和肝臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，TUDCA組肝臟TNF-α的表達(dá)量顯著下降，在大體及RNA水平均顯示肝臟損傷減輕，表明LPS入血減少。由于高濃度膽汁酸對(duì)于腸道菌群強(qiáng)烈的選擇性抑制作用，使用TUDCA處理后上調(diào)厚壁菌門(mén)在腸道菌群中的比例，下調(diào)腸道菌群中擬桿菌門(mén)的比例，降低腸道菌群的豐度，同時(shí)減少菌群分泌LPS的入血，最終增加肝臟膽汁酸的合成、減少小鼠體內(nèi)血清及肝臟的膽固醇積聚。這與本研究發(fā)現(xiàn)的小鼠膽囊膽汁膽汁酸含量上升，血清及肝臟膽固醇含量顯著下降的結(jié)果一致。機(jī)制簡(jiǎn)圖見(jiàn)圖10。

綜上所述，本研究表明TUDCA預(yù)防小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成，其機(jī)制包括：①通過(guò)增加膽汁酸親水性，抑制小腸膽固醇吸收和肝臟膽固醇負(fù)荷，降低肝臟Abcg5和Abcg8表達(dá),以減少分泌膽汁中的膽固醇，進(jìn)而降低膽固醇飽和指數(shù)；②TUDCA因其親水特性，降低膽汁中膽汁酸的疏水指數(shù)，進(jìn)而增加膽固醇在膽汁中的溶解度；③TUDCA可增加腸道厚壁菌門(mén)比例、降低擬桿菌門(mén)的比例，可能促進(jìn)膽汁酸合成，并減少LPS入血造成肝臟炎癥。

圖10 TUDCA降低膽囊膽固醇結(jié)石成石率的機(jī)制簡(jiǎn)圖