三聚磷酸鈉對(duì)豬肉肌原纖維蛋白功能特性的影響

葉 浪，李美良，趙 冰，周慧敏，李 素，潘曉倩，張順亮,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；2.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

肌原纖維蛋白（myofibril protein，MP）是一類具有重要生物學(xué)功能特性的鹽溶性蛋白群，是肉制品中最重要的功能性蛋白質(zhì)，主要包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白等[1]。加熱是肉制品加工中的常用工序，能使MP發(fā)生變性，也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后重新交聯(lián)形成凝膠的重要條件。Lanier等[2]認(rèn)為，MP對(duì)肉中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)起到?jīng)Q定性作用。在肉制品熱加工中，MP會(huì)發(fā)生一系列物理化學(xué)變化，形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予肉制品良好的凝膠特性和感官特性[3-4]。三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）是一種常見(jiàn)食品添加劑，具有較高水溶解性。肉制品中添加STP會(huì)影響其質(zhì)構(gòu)、色澤等特性，降低產(chǎn)品蒸煮損失，增加產(chǎn)品出品率[5]。STP可以與蛋白質(zhì)中的氨基酸或羥基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)引入磷酸基團(tuán)而改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[6]。在蛋白質(zhì)溶液中添加STP，可有效改善其凝膠強(qiáng)度及保水性。Fukazawa等[7]研究表明，STP能夠弱化肌動(dòng)球蛋白中肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白之間的作用力，增大肌動(dòng)球蛋白的解離程度。Eilert等[8]研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽能提高產(chǎn)品保水性和乳化穩(wěn)定性。

近年來(lái)，有關(guān)肉制品的研究主要是通過(guò)使用添加物或改變加工工藝條件來(lái)改善其品質(zhì)，而對(duì)改善MP功能性質(zhì)的研究相對(duì)較少。本研究以豬肉MP為研究對(duì)象，探討5 種不同質(zhì)量濃度STP對(duì)MP功能特性的影響，并進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為STP改善肉制品質(zhì)構(gòu)的作用機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為肉制品加工提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬4號(hào)肉（從最后腰椎與薦椎間垂直切下并除去后肘的部分豬后腿部位肌肉） 北京市豐臺(tái)區(qū)永輝超市；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、NaCl、MgCl2、三氯乙酸、Na2HPO4、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、戊二醛、三氯甲烷、叔丁醇、溴酚藍(lán)、尿素（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LYNX 4000冷凍離心機(jī) 北京科德遠(yuǎn)揚(yáng)科技有限公司；XH-C旋渦混合器 江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠；WFZ UV-20紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；AM-3均質(zhì)機(jī) 日本Nihonseiki Kaisha公司；PMT 49984酶標(biāo)儀 美國(guó)Biotek Instruments公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 MP提取

參考Xiong[9]的方法，并有所改動(dòng)。取冷凍豬4號(hào)肉于4 ℃解凍后，用5 倍體積提取緩沖液（含0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA-2Na和10 mmol/L Na2HPO4，pH 7.4）高速勻漿（10 000 r/min），7 600 r/min離心10 min，重復(fù)2 次得到粗MP；用5 倍體積pH 7.4的0.1 mol/L NaCl溶液高速勻漿（10 000 r/min），7 600 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，最后1 次用4 層紗布過(guò)濾漿液，并用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，最后7 600 r/min離心10 min得到沉淀，即為純化MP，4 ℃冰箱貯藏，備用。

用BCA試劑盒測(cè)定MP濃度。將提取的MP溶于0.6 mol/L NaCl溶液中，分別添加質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL的STP，以未添加STP的MP溶液為對(duì)照組，測(cè)定MP的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、表面疏水性、凝膠強(qiáng)度和凝膠保水性。所有實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3 次。

1.3.2 MP乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Agyare等[10]的方法，并有所改動(dòng)。將MP溶解在0.6 mol/L、pH 6.5的NaCl溶液中，配制成MP質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液；將2.0 mL大豆油和8.0 mL MP溶液在轉(zhuǎn)速10 000 r/min條件下高速勻漿1 min，立即從距杯底0.5 cm處取100 μL勻漿液加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后用紫外分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作A0；勻漿后10 min再次在相同位置取勻漿液100 μL，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后測(cè)定吸光度，記作A10，用0.1% SDS溶液作為空白對(duì)照組。MP勻漿液的乳化性和乳化穩(wěn)定性按照公式（1）～（2）計(jì)算。

式中：A500nm為樣品在500 nm波長(zhǎng)處的吸光度；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（φ＝0.25）；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.3 MP起泡性及起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Wang Guang等[11]的方法，并有所改動(dòng)，測(cè)定MP的起泡性和起泡穩(wěn)定性。取10 mL 5 mg/mL的MP溶液，在10 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，迅速倒入50 mL量筒，讀取泡沫體積，靜置30 min后，再次讀取泡沫體積。起泡性和起泡穩(wěn)定性按照公式（3）～（4）計(jì)算。

式中：V為MP溶液體積/mL；V0為均質(zhì)2 min后泡沫體積/mL；V30為靜置30 min后泡沫體積/mL。

1.3.4 MP表面疏水性的測(cè)定

參考Chelh等[12]的方法，測(cè)定不同磷酸化程度MP的表面疏水性。取不同磷酸化程度的MP溶液2 mL，加入到10 mL離心管中，加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，室溫?cái)嚢?0 min，然后3 040 r/min離心15 min；取上清液在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以未添加MP溶液的20 mmol/L、pH 6.0磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，以與蛋白質(zhì)結(jié)合的溴酚藍(lán)質(zhì)量表示蛋白質(zhì)的表面疏水性。表面疏水性按照公式（5）計(jì)算。

式中：40為加入溴酚藍(lán)溶液的質(zhì)量/μg；A0為空白組吸光度；A為樣品吸光度。

1.3.5 MP凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考趙冰等[13]的方法，并有所改動(dòng)。將STP分別以質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL添加至MP中，再添加一定量的0.6 mol/L NaCl溶液，使最終溶液體積與MP的質(zhì)量比為3∶2；攪拌均勻后離心（1 520 r/min、4 ℃、10 min）排除氣泡，25 ℃水浴中以1 ℃/min加熱至70 ℃后恒溫加熱30 min，迅速取出，冷水冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱冷藏過(guò)夜，測(cè)定前將樣品在室溫條件下放置1 h，采用TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行凝膠強(qiáng)度測(cè)定。

質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定：在弱凝膠強(qiáng)度模式下采集數(shù)據(jù)，探頭型號(hào)選擇P/0.5；實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：測(cè)試前速率1.0 mm/s，觸發(fā)力5.0 g，測(cè)試速率0.5 mm/s，返回速率10.0 mm/s，測(cè)試循環(huán)1 次，測(cè)試距離10 mm。

1.3.6 MP凝膠保水性的測(cè)定

參考趙冰等[14]的方法，并有所改動(dòng)。將制備好的MP凝膠取出，在室溫（22±2） ℃條件下放置30 min；取5 g凝膠樣品離心（3 800 r/min、15 min），去除離心后水分，稱凝膠質(zhì)量。凝膠保水性按照公式（6）計(jì)算。

式中：ma為離心后凝膠質(zhì)量/g；mp為離心管質(zhì)量/g；mb為離心前凝膠質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以最小顯著性差異（least-significant difference，LSD）法（P＜0.05）進(jìn)行數(shù)據(jù)間的顯著性分析，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)方差分析和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP的乳化性及乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)乳化作用主要是由于蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)具有親油性，可作為油和水之間的一個(gè)良好介質(zhì)，降低二者接觸時(shí)的表面張力，使油與水結(jié)合能力增強(qiáng)。乳化性越大，表明MP乳化能力越強(qiáng)，單位質(zhì)量乳化的油越多[15]。

由圖1可知，與對(duì)照組相比，添加STP后MP的乳化性顯著升高（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.0～0.4 g/100 mL時(shí)，MP的乳化性逐漸增強(qiáng)，最高為（29.85±0.51） m2/g；STP質(zhì)量濃度為0.4～0.5 g/100 mL時(shí)，MP乳化性逐漸降低。Zorba等[16]研究磷酸鹽濃度對(duì)MP乳化性的影響，結(jié)果表明，MP的乳化性隨磷酸鹽含量增加而增強(qiáng)；與對(duì)照組相比，磷酸鹽添加量為0.50%和0.75%時(shí)，MP的乳化性分別提高22.3%和23.0%。本研究結(jié)果與其相符，可能是由于添加STP后MP上引入磷酸基團(tuán)，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)分子伸展，大量疏水基團(tuán)暴露，與非極性油分子相連，而親水基團(tuán)則和水分子相連，有利于形成更多較強(qiáng)界面膜，減少油滴聚集能力[17]。

乳化穩(wěn)定性是判斷蛋白質(zhì)乳化特性的主要指標(biāo)。乳化穩(wěn)定性可表征蛋白質(zhì)油-水混合體系對(duì)外界的抗應(yīng)變能力。乳化穩(wěn)定性越高，蛋白質(zhì)的抗應(yīng)變能力越強(qiáng)。

由圖2可知，與對(duì)照組相比，添加STP后MP的乳化穩(wěn)定性顯著升高（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.2～0.5 g/100 mL時(shí)，隨其質(zhì)量濃度的升高，MP乳化穩(wěn)定性升高；STP質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時(shí)，MP乳化穩(wěn)定性最高，為（38.79±3.02）%。Yapar等[18]研究磷酸鹽對(duì)鯉魚(yú)魚(yú)肉乳化能力的影響，結(jié)果表明，乳化穩(wěn)定性隨磷酸鹽的增加極顯著增加。本研究結(jié)果與其相符。乳濁液中相鄰2 個(gè)界面膜之間磷酸基的靜電作用可以阻止乳濁液聚集，添加STP后，蛋白質(zhì)水化性增強(qiáng)，有利于液滴間的分散，從而增強(qiáng)體系穩(wěn)定性[19]。

2.2 MP的起泡性及起泡穩(wěn)定性

由圖3可知，與對(duì)照組相比，添加STP后MP的起泡性極顯著增加（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.0～0.3 g/100 mL時(shí)，MP的起泡性逐漸增大，最高為（84.85±2.50）%；當(dāng)STP質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，MP的起泡性逐漸下降。蛋白質(zhì)起泡性由蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散、界面張力及疏水基團(tuán)含量和分布等決定，隨著STP質(zhì)量濃度的增加，MP上結(jié)合的磷酸基團(tuán)增加，使MP等電點(diǎn)降低，蛋白質(zhì)附帶更多負(fù)電荷，溶解度升高，起泡性增強(qiáng)[20-21]。

由圖4可知，與對(duì)照組相比，添加STP后MP的起泡穩(wěn)定性極顯著增加（P＜0.01）。隨著STP質(zhì)量濃度的增加，MP的起泡穩(wěn)定性逐漸增大，當(dāng)STP質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時(shí)，MP的起泡穩(wěn)定性最大，為（78.57±1.40）%。添加STP后MP引入磷酸基團(tuán)，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，泡沫界面黏性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)易于吸附在氣泡表面，氣泡致密均一、界面膜增厚，阻止了分子擴(kuò)散[22-23]。

2.3 MP的表面疏水性

由圖5可知，與對(duì)照組相比，添加STP后MP的表面疏水基含量顯著降低（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.0～0.4 g/100 mL時(shí)，隨著STP質(zhì)量濃度的增大，MP的表面疏水基含量逐漸降低，最低為（3.99±0.20） μg。這是由于磷酸化后MP電負(fù)性增加，溶解性增加，使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，增強(qiáng)了疏水基團(tuán)與溴酚藍(lán)的結(jié)合能力，所測(cè)得的疏水基團(tuán)含量降低[14]。表明磷酸化對(duì)MP結(jié)構(gòu)的改變產(chǎn)生了顯著影響，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力減弱[24]。

2.4 MP的凝膠強(qiáng)度

由圖6可知，與對(duì)照組相比，STP質(zhì)量濃度為0.1～0.5 g/100 mL時(shí)，MP的凝膠強(qiáng)度極顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.1～0.3 g/100 mL時(shí)，隨其質(zhì)量濃度升高，MP的凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)；STP質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL時(shí)，MP的凝膠強(qiáng)度最大，為745.7 g。鄧麗等[25]研究表明，添加STP后MP引入磷酸基團(tuán)，電負(fù)性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)間靜電作用增加，蛋白質(zhì)相互交聯(lián)作用增強(qiáng)，分子間結(jié)合穩(wěn)定性增高，形成更加致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使MP凝膠強(qiáng)度增大。本研究中，STP質(zhì)量濃度為0.3～0.5 g/100 mL時(shí)，隨其質(zhì)量濃度升高，MP凝膠強(qiáng)度降低，這可能是由于未與蛋白質(zhì)結(jié)合的STP較多，使整個(gè)體系pH值升高，分子間靜電力增大，影響熱誘導(dǎo)過(guò)程中蛋白質(zhì)的聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度降低[26-27]。

2.5 MP的凝膠保水性

由圖7可知，與對(duì)照組相比，STP質(zhì)量濃度為0.2～0.5 g/100 mL時(shí)，MP的凝膠保水性極顯著增高（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.4 g/100 mL時(shí)，MP的凝膠保水性最高，為（77.8±1.10）%。這可能是由于MP引入磷酸基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)分子的電負(fù)性，肌動(dòng)球蛋白解離成肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的速率增大，疏水基團(tuán)增多，MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)空間增大，蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合位點(diǎn)增加，使更多水分被保留下來(lái)[28-29]。STP質(zhì)量濃度為0.4～0.5 g/100 mL時(shí)，隨其質(zhì)量濃度升高，MP的凝膠保水性降低。這可能是由于STP質(zhì)量濃度過(guò)高引起蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均一性變差，導(dǎo)致保水性下降[30]。

2.6 MP功能特性的相關(guān)性分析

表 1 MP功能特性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of functional properties of MP

由表1可知，MP的起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），乳化性與乳化穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Rodriguez等[31]認(rèn)為，表面張力降低是蛋白質(zhì)乳化和起泡的首要條件，其下降程度能反映蛋白質(zhì)展開(kāi)和重排能力的大小。闞健全[32]、Graham[33]等研究表明，蛋白質(zhì)的表面張力和表面張力變化率與乳化性和乳化穩(wěn)定性呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)表面張力變化率與起泡性、起泡穩(wěn)定性呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)變性會(huì)降低溶液表面張力。MP的起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性與表面疏水性均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與凝膠保水性均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這可能是由于添加STP后MP的大量疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)快速遷移到界面，形成穩(wěn)定界面薄膜，有利于乳狀液和泡沫形成，這與Nakai[34]的研究結(jié)果相符。而鄭文彬等[35]研究蕓豆蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的結(jié)果表明，乳化穩(wěn)定性與表面疏水性呈顯著負(fù)相關(guān)，可能是由于蛋白質(zhì)之間的相互作用降低了蛋白質(zhì)膜穩(wěn)定脂肪的能力。MP的表面疏水性與凝膠保水性呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），這可能是由于MP引入磷酸基團(tuán)，疏水基團(tuán)增多，MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)空間增大，蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合位點(diǎn)增加，使更多水分被保留下來(lái)。周心雅等[36]研究表明，MP的表面疏水性與凝膠硬度和凝膠白度極顯著正相關(guān)，與MP的溶解度、乳化活性及凝膠保水性極顯著負(fù)相關(guān)，表明疏水基團(tuán)暴露程度越大，MP的溶解度、乳化活性及凝膠保水性越差。MP的表面疏水性與凝膠強(qiáng)度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這可能是由暴露的疏水基團(tuán)在凝膠形成過(guò)程中又被包裹在凝膠網(wǎng)絡(luò)中導(dǎo)致[37]。因此，改善MP的乳化性、起泡性和表面疏水性等界面性質(zhì)可增強(qiáng)其凝膠特性。

3 結(jié) 論

探討不同質(zhì)量濃度STP的添加對(duì)MP功能特性的影響，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：STP可以增強(qiáng)MP的功能特性，其質(zhì)量濃度為0.3～0.4 g/100 mL時(shí)效果最佳；改善MP的乳化性、起泡性和表面疏水性等界面性質(zhì)可增強(qiáng)其凝膠特性。