吹掃/捕集-熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同解凍溫度對牛肉風(fēng)味品質(zhì)的影響

潘曉倩，張順亮*，李 素，周慧敏，趙 冰，喬曉玲，陳文華，李家鵬，曲 超

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

牛肉是我國的第二大肉類食品，不僅味道鮮美，且具有極高的營養(yǎng)價值，其氨基酸組成更接近人體需要，具有較高的經(jīng)濟價值。近年來，牛肉消費量快速增長，品質(zhì)要求也日益嚴格[1-2]。冷凍是目前肉品貯藏保鮮最主流且經(jīng)濟可行的方式，冷凍肉也是地區(qū)間流通和進出口貿(mào)易中原料肉的主要形態(tài)[3-4]。冷凍肉品在食用或深加工之前一般都需要進行解凍。解凍是冰結(jié)晶還原溶解成水，同時恢復(fù)肉品原有狀態(tài)和特性的工藝過程[5]。而凍結(jié)和解凍過程是非常復(fù)雜的熱傳遞過程，其中發(fā)生的物理損傷、蛋白質(zhì)氧化變性、脂質(zhì)氧化和微生物繁殖等不良反應(yīng)會不可避免地造成肉品品質(zhì)下降，包括汁液流失、色澤劣變、風(fēng)味損失及結(jié)構(gòu)和質(zhì)地改變等[6-7]。一般來講，冷凍肉品的品質(zhì)與凍結(jié)和解凍過程密切相關(guān)，適宜的解凍方案可大大降低凍結(jié)和解凍過程中的損失[4,8]。

與頂空固相微萃取法相比，吹掃/捕集-熱脫附（purge and trap thermal desorption system，P&T-TDS）具有吸附率高、對痕量物質(zhì)較敏感等優(yōu)點，對樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的組成反應(yīng)更加真實且完整[9]。電子鼻能夠?qū)⒉煌瑲饷魝鞲衅鞯淖饔棉D(zhuǎn)化為方便計算的可測物理信號，實現(xiàn)氣體混合分析[10]。近年來，有許多關(guān)于肉類解凍方式的比較研究。雖然微波解凍[11]、超聲波解凍[12]、高壓靜電場解凍[13]等新型解凍技術(shù)能夠縮短解凍時間，但仍有許多局限性，以至于并未全面推廣，空氣解凍和水解凍法仍是目前最常用的解凍方式[14-15]。肉類富含蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和硫胺素等重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，不同解凍方式對這些營養(yǎng)物質(zhì)的破壞程度不同，使其風(fēng)味成分發(fā)生變化[16-18]。國內(nèi)外已有一些關(guān)于解凍方式對肉品感官及風(fēng)味品質(zhì)的影響研究[17-19]，例如，余力等[16]研究指出，解凍處理與伊拉兔肉揮發(fā)性醛類物質(zhì)的相對含量呈正相關(guān)，而與醇類物質(zhì)的相對含量呈顯著負相關(guān)；李俊麗等[18]發(fā)現(xiàn)，解凍溫度越低，熟制后的灘羊肉中風(fēng)味物質(zhì)種類越多；沈麗等[20]對冰鮮牡蠣進行不同解凍時間處理，發(fā)現(xiàn)醛酮類風(fēng)味物質(zhì)含量隨解凍時間延長而減少。綜上所述，國內(nèi)外對解凍肉的研究主要集中在揮發(fā)性成分方面的分析，而對于不同溫度梯度對解凍肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響的研究較少。

本研究以新鮮牛霖為原料，經(jīng)－30 ℃靜止空氣凍結(jié)后，在5、10、15 ℃ 3 個解凍溫度下進行解凍，記錄牛肉中心溫度變化，當(dāng)解凍完成時，利用P&T-TDS結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測其揮發(fā)性風(fēng)味成分，并結(jié)合電子鼻傳感器分析風(fēng)味物質(zhì)的組成與變化，為生產(chǎn)加工過程中冷凍牛肉最佳解凍方案的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛霖 河北福成五豐食品股份有限公司；氯化鈉（分析純） 北京化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Gerstel TDS半自動熱脫附進樣器、Tenax TA石英玻璃吸附管 德國Gerstel公司；吹掃捕集器 自制；TRACE 1310-TSQ 8000 GC-MS聯(lián)用儀、TG-Wax MS氣相色譜毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PEN3便攜式電子鼻傳感器德國Airsense公司；ME104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SSN-11E中心溫度記錄儀深圳宇問加壹傳感系統(tǒng)有限公司；Binder KBF恒溫恒濕箱 德國Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉凍結(jié)處理

將新鮮整塊牛霖去除表面脂肪、筋膜及可分離結(jié)締組織，切成質(zhì)量相近、形狀相似（（800±20） g，15 cm×10 cm×8 cm）的肉塊，隨機分為4 組，每組3 份，用聚乙烯薄膜包裝好，在－30 ℃條件下速凍，待中心溫度達到－18 ℃后取出，在－18 ℃的冰箱中冷凍7 d，其中對照組不進行凍結(jié)-解凍處理。測定項目均選取瘦肉部分進行測定。

1.3.2 牛肉解凍處理

凍藏結(jié)束后，用電鉆在肉塊側(cè)面中心位置鉆孔并插入中心溫度記錄儀，以未經(jīng)冷凍-解凍處理的新鮮牛肉為對照組，其余3 組牛肉樣品分別置于相對濕度恒定為50%，溫度分別為5、10、15 ℃的恒溫恒濕箱中進行解凍，至肉塊中心溫度達到2 ℃時記為解凍終點，并進行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.3 電子鼻分析

將待測牛肉樣品切碎并準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品置于10 mL樣品瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)為3%的氯化鈉，密封，室溫環(huán)境平衡2 h，運用PEN3型便攜式電子鼻傳感器對4 組樣品進行測定。傳感器響應(yīng)信號在60 s后趨于穩(wěn)定，本研究選取70 s為信號采集時間[21]。每組牛肉樣品做6 次平行重復(fù)測定。

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

1.3.4.1 P&T-TDS處理

準(zhǔn)確稱取10.00 g待測樣品置于P&T樣品瓶中，加入質(zhì)量分數(shù)為3%的氯化鈉和1 μL內(nèi)標(biāo)化合物（質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮），樣品瓶一端吹掃流速為50 mL/min的氮氣，另一端接裝有Tenax TA吸附劑的吸附管（事先老化至無色譜雜峰），55 ℃保溫吸附40 min后，取出吸附管插入TDS進樣口進樣。

TDS條件：標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；氦氣流速20 mL/min；不分流；初始溫度為40 ℃，延遲0.1 min，保持1 min，再以60 ℃/min上升至220 ℃，保持10 min；傳輸線溫度225 ℃。

冷進樣（cold injection system，CIS）條件：標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；液氮冷卻，初始溫度為－100 ℃，平衡0.1 min，再以10 ℃/min上升至225 ℃，保持10 min，分流比30∶1。

1.3.4.2 GC-MS測定

GC和MS條件設(shè)定參考潘曉倩等[22]的方法，其中GC方法略作修改。GC方法：以高純氦氣（純度＞99.99%）作為載氣，流速1.0 mL/min，不分流；升溫程序：進樣口溫度250 ℃，初始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升溫至220 ℃，保持10 min。

1.3.4.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分鑒定

定性分析：通過揮發(fā)性風(fēng)味成分的MS圖，檢索NIST譜庫，對不同解凍溫度條件下牛肉的揮發(fā)性組分進行定性分析，其中選擇匹配度和反匹配度均大于750（最大值1 000）的化合物。

半定量分析：通過已知內(nèi)標(biāo)2-甲基-3-庚酮的質(zhì)量濃度，依據(jù)化合物峰面積比值與質(zhì)量濃度呈正比的原理，計算每一種化合物相對于內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度。未知揮發(fā)性化合物含量按照公式（1）計算。

式中：Cx為未知揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；C0為內(nèi)標(biāo)化合物含量/（μg/μL）；V0為內(nèi)標(biāo)化合物進樣體積/μL；Sx為未知揮發(fā)性化合物的峰面積/（AU·min）；S0為添加的內(nèi)標(biāo)化合物峰面積/（AU·min）；m為樣品質(zhì)量/kg。

氣味活度值（odor activity value，OAV）按照公式（2）計算。

式中：C為樣品中測得的風(fēng)味物質(zhì)含量/（μg/kg）；T為該風(fēng)味物質(zhì)在水中的感覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并計算標(biāo)準(zhǔn)差；電子鼻測定結(jié)果運用其配套的Winmuster軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同解凍溫度牛肉樣品的電子鼻分析

采用PCA法和LDA法建立4 組產(chǎn)品的響應(yīng)模型。由圖1可知，第1主成分和第2主成分（PC1和PC2）的貢獻率分別為97.91%和1.77%，總貢獻率為99.68%。在LDA中，線性判別函數(shù)LD1和LD2的貢獻率分別為73.81%和14.40%，總貢獻率為88.21%。

由PCA和LDA結(jié)果可知，對照組與不同溫度條件解凍的牛肉產(chǎn)品可以用電子鼻較好地進行區(qū)分。其中PCA顯示的主要是兩維散點圖，而LDA是利用所有傳感器的信號，且進行了Fisher線性變換，削弱了某些不敏感傳感器的負面效應(yīng)，更注重樣品的空間分布狀態(tài)及彼此間的距離分析[23]。

由圖1B可知，LDA顯示出對照組和5、10、15 ℃解凍組牛肉產(chǎn)品基本上朝LD2方向呈一定的變化趨勢，15 ℃解凍的牛肉樣品在LD2軸上有一個明顯的上升趨勢，區(qū)別于其他組牛肉樣品，這可能是由于其對應(yīng)主軸上的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分濃度隨解凍溫度的升高而增大。5、10 ℃解凍組樣品距離較近，說明2 組產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味成分之間的變化波動較小。

2.2 不同解凍溫度牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析

表 1 不同解凍溫度牛肉揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis of volatile compounds from frozen beef thawed at different temperatrures

續(xù)表1

續(xù)表1

由表1可知，在對照組和5、10、15 ℃解凍組牛肉中分別檢測出62、63、63、62 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總含量分別為2 017.81、751.91、689.83、770.98 μg/kg?？梢?，沒有經(jīng)過冷凍-解凍處理的冷鮮牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量更加豐富，解凍會造成肉品風(fēng)味物質(zhì)損失。

對照組和5、10、15 ℃解凍組牛肉中分別檢測出酸類物質(zhì)5、4、4、5 種，總含量分別為61.98、22.97、27.57、11.59 μg/kg，醇類物質(zhì)分別檢測出6、8、5、7 種，總含量分別為82.28、88.70、64.49、22.14 μg/kg。其中1-辛烯-3-醇具有蘑菇香味，是典型的肉香型活性化合物，來源于脂質(zhì)氧化[24]，在4 組產(chǎn)品中的含量分別為26.34、29.68、20.40、1.60 μg/kg，當(dāng)解凍溫度升高至15 ℃時，該物質(zhì)含量顯著降低。2-乙基己醇具有玫瑰香和青草香[25]，在15 ℃解凍牛肉樣品中含量為8.04 μg/kg，也明顯低于其他3 組樣品。

醛類物質(zhì)是構(gòu)成肉品特征風(fēng)味的重要物質(zhì)，一般由脂肪降解及氧化產(chǎn)生[16]，尤其是5～9 個碳原子的醛常具有清香、油香和牛脂香。對照組和5、10、15 ℃解凍組牛肉中分別檢測出6、6、11、6 種醛類物質(zhì)，總含量分別為173.11、72.23、128.33、30.58 μg/kg。其中，反-2-辛烯醛、（Z）-2-壬烯醛、十二醛和反,反-2,4-癸二烯醛僅在10 ℃解凍牛肉中檢出；己醛、庚醛、壬醛來源于脂質(zhì)氧化，在5、10、15 ℃解凍組牛肉中，己醛和壬醛的含量均呈先升高后又下降的趨勢。這可能是由于5 ℃解凍溫度較低，延緩了風(fēng)味物質(zhì)的形成[16]，解凍溫度升高后有利于脂肪氧化產(chǎn)生醛類物質(zhì)，但溫度繼續(xù)升高后這些物質(zhì)會進一步降解氧化。

酮類物質(zhì)多來源于多不飽和脂肪酸的氧化分解、氨基酸降解及微生物氧化，研究表明，冷鮮牛肉低溫貯藏過程中，酮類物質(zhì)是變化最為顯著的一類物質(zhì)[26]。對照組和5、10、15 ℃解凍組牛肉中均檢測出4 種酮類物質(zhì)，總含量分別為436.76、73.82、79.64、124.41 μg/kg，這主要源于3-羥基-2-丁酮含量的變化。解凍溫度升高至15 ℃時，3-羥基-2-丁酮含量迅速升高。3-羥基-2-丁酮具有紅草莓香味，是肉制品主要的特征揮發(fā)性風(fēng)味成分[24-25]；而顧賽麒等[27]研究豬肉中有害微生物時發(fā)現(xiàn)，有氧條件下，熱死環(huán)絲菌可分解葡萄糖產(chǎn)生乙酸和3-羥基-2-丁酮。由此推斷，3-羥基-2-丁酮可在一定含量范圍內(nèi)提供有益風(fēng)味。

對照組和5、10、15 ℃解凍組牛肉中分別檢測出11、12、10、8 種酯類物質(zhì)，總含量分別為113.78、39.88、52.86、99.91 μg/kg。酯類物質(zhì)來自于酸和醇的酯化反應(yīng)，隨著解凍溫度的升高，酯類物質(zhì)含量增加，這可能是由于溫度升高促進了微生物的生長繁殖，而微生物酯化產(chǎn)生了更多酯類物質(zhì)。烴類物質(zhì)閾值較高，對樣品整體風(fēng)味貢獻較小，包括烷烴、烯烴和芳香烴。

胺類物質(zhì)通常來源于肉品腐敗過程，具有令人不愉悅的氣味，如蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)在微生物產(chǎn)生的蛋白酶作用下發(fā)生脫羧和脫氨反應(yīng)[28]。對照組和5 ℃解凍組牛肉樣品中未檢測到胺類物質(zhì)，10 ℃解凍組檢測出O-癸基羥胺，含量為0.59 μg/kg，15 ℃解凍組檢測出O-癸基羥胺和己內(nèi)酰胺，含量分別為1.67、12.00 μg/kg?？梢?，解凍溫度升高會加快肉品腐敗過程。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分OAV分析

風(fēng)味特征與揮發(fā)性物質(zhì)含量沒有直接關(guān)聯(lián)，風(fēng)味體系中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度與感覺閾值共同決定其對總體風(fēng)味的貢獻。一般認為，OAV≥1的物質(zhì)為樣品的主體風(fēng)味成分，對整體風(fēng)味有直接影響，且OVA越大對樣品總體風(fēng)味的貢獻也就越大[29]。

表 2 不同解凍溫度牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OAVTable 2 OAVs of volatile compounds in frozen beef thawed at different temperatures

由表2可知，不同解凍溫度牛肉樣品中OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)共有15 種，其中醇類物質(zhì)2 種、醛類物質(zhì)7 種、酮類物質(zhì)2 種、烯烴類物質(zhì)2 種、芳香族化合物1 種、雜環(huán)類化合物1 種。對照組牛肉樣品中OAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)共有10 種，5、10、15 ℃解凍組牛肉中分別有8、11、11 種，可見隨著解凍溫度升高，樣品主體風(fēng)味成分種類增多。

3 結(jié) 論

通過電子鼻和GC-MS對新鮮牛肉及不同解凍溫度牛肉中的揮發(fā)性成分變化進行研究。結(jié)果表明：牛肉的特征風(fēng)味物質(zhì)主要由醛、醇、酮及烯烴類化合物構(gòu)成，且經(jīng)過凍結(jié)、解凍處理后的牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量明顯低于新鮮牛肉；隨著解凍溫度的升高，醇類物質(zhì)含量呈下降趨勢，醛類物質(zhì)含量先升高后又下降，而酮類和酯類含量有升高的趨勢，15 ℃解凍牛肉樣品的烯烴類物質(zhì)含量明顯增加；胺類物質(zhì)隨著解凍溫度的升高開始出現(xiàn)，且含量隨溫度升高而增加；醛酮類化合物主要來源于肉中多不飽和脂肪酸的氧化或氨基酸降解，綜合不同解凍溫度條件下牛肉樣品中各類風(fēng)味物質(zhì)含量的變化推測，溫度升高會促進脂肪氧化生成更多的醛酮類物質(zhì)，但溫度升高同時會導(dǎo)致脂肪的過度氧化，15 ℃解凍牛肉樣品中醇類含量下降，而酮類和酯類含量升高，這可能是由于醇類物質(zhì)進一步氧化生成酮類物質(zhì)，同時溫度升高促進微生物的生長繁殖，由此通過微生物的酯化反應(yīng)生成更多的酯類物質(zhì)，且肉中蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)在微生物產(chǎn)生的蛋白酶作用下發(fā)生脫羧和脫氨反應(yīng)，產(chǎn)生胺類等令人不愉悅的氣味。