苯乙醇胺A熒光免疫層析試紙條的制備及特性

郭會(huì)燦，李君華，王麗君，李春生,*

（1.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050000）

苯乙醇胺A（phenylethanolamine A，PEAA）又稱為克倫巴胺，其分子式為C19H24N2O4，一般以鹽酸鹽的形式存在，屬于人工合成化學(xué)物質(zhì)。PEAA與萊克多巴胺和鹽酸克侖特羅屬于同類物質(zhì)，均屬于β2-激動(dòng)劑的一種，長(zhǎng)期使用可以增加瘦肉率并縮短出欄周期。PEAA在體內(nèi)具有蓄積性，人長(zhǎng)期食用可出現(xiàn)肌肉震顫、頭暈等癥狀，可誘發(fā)高血壓、心臟病等[1-3]。

農(nóng)業(yè)部第1519號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的物質(zhì)》[4]宣布，PEAA被列入禁止添加劑，并應(yīng)加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管，嚴(yán)厲打擊非法濫用瘦肉精類物質(zhì)。PEAA屬于一類新型的化學(xué)物質(zhì)，關(guān)于PEAA的研究報(bào)道較少，對(duì)于PEAA的檢測(cè)方法目前還不成熟。目前，PEAA的常用檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[5-7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-10]和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[11-13]，這些方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但是需要精密的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作人員，且檢測(cè)成本高，適合用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[14-16]，不適合基層的初篩工作。近年來(lái)，隨著熒光免疫層析技術(shù)的不斷成熟，再加上其靈敏度高、準(zhǔn)確性好、能夠定量的特點(diǎn)，被廣泛用于各類獸藥殘留的檢測(cè)研究中[17-19]。李丹妮等[20]制備β-受體激動(dòng)劑熒光免疫層析試紙條，克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇試紙條的檢測(cè)下限分別可達(dá)0.2、0.4、0.5 μg/L。李靜宇等[21]制備克倫特羅熒光免疫層析試紙條，檢測(cè)限可達(dá)0.35 μg/L。而PEAA作為一種新型的β2-激動(dòng)劑，目前的研究還處于初期階段，尚未見(jiàn)關(guān)于PEAA熒光免疫層析法的研究報(bào)道。

本研究采用重氮化法合成PEAA人工抗原，通過(guò)免疫BALB/c小鼠，融合篩選得到高特異性、高效價(jià)的抗PEAA單克隆抗體，并建立PEAA熒光免疫層析方法，通過(guò)對(duì)其靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立一種高靈敏度、高特異性、快速、準(zhǔn)確測(cè)定PEAA的熒光免疫層析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/c小鼠來(lái)自河北省科學(xué)院生物研究所。

PEAA（純度≥98.0%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國(guó)Sigma公司；甲醇、鹽酸、氨基磺酸、亞硝酸鈉、N,N-二甲基苯胺、鋅粉、水合肼、尿素、鈀碳催化劑（均為分析純） 天津大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

722紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光學(xué)儀器廠；TDZ4-WS臺(tái)式低速自動(dòng)離心機(jī) 湖南湘儀儀器有限公司；T-Meter Ⅰ熒光免疫分析儀 河北特溫特生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重氮化法制備免疫抗原

重氮化法[22]制備免疫抗原PEAA-BSA：1）將6 mg PEAA溶于15 mL乙醇，持續(xù)攪拌，當(dāng)溫度升至80 ℃時(shí)，加入28 μL水合肼和10 mg鈀碳催化劑，還原反應(yīng)10 h，用硅膠薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）監(jiān)測(cè)，之后真空抽濾去除溶劑，得到黃色粗品，即PEAA-NH2；2）稱取上述PEAA-NH29.6 mg，溶于300 μL水中，加入3.1 mg/100 μL的NaNO2溶液300 μL，溶液用0.2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至1.5，4 ℃暗處反應(yīng)7 h；3）反應(yīng)過(guò)程用N,N-二甲基苯胺進(jìn)行監(jiān)測(cè)，用質(zhì)量濃度為55 mg/mL的尿素溶液中止反應(yīng)；4）將90 mg BSA溶于1.5 mL PBS中，邊加邊攪拌，溶液pH值用1 mol/L NaOH調(diào)至7.5，反應(yīng)3 h，得到偶聯(lián)物PEAA-BSA；5）偶聯(lián)物PEAA-BSA經(jīng)低濃度PBS透析72 h，期間換液6 次，3 000 r/min離心即得PEAA-BSA。PEAA-BSA的合成路線圖如圖1所示。

1.3.2 免疫抗原的鑒定

1.2.2.1 紫外掃描

在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描PEAA、BSA及偶聯(lián)物PEAA-BSA，以確定是否成功偶聯(lián)。

1.2.2.2 偶聯(lián)比測(cè)定

BSA和PEAA質(zhì)量濃度測(cè)定均采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，偶聯(lián)比按照公式（1）計(jì)算[23]。

式中：A為吸光度；ρ為質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.2.2.3 免疫

采用傳統(tǒng)免疫方法，用合成的PEAA人工抗原免疫BALB/c小鼠。共進(jìn)行4 次免疫，斷尾取血，測(cè)定效價(jià)，選取效價(jià)高的小鼠采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行融合，制備抗PEAA單克隆抗體。

1.3.3 熒光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）標(biāo)記PEAA單克隆抗體

采用1-乙基-3-（3’-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽-N-羥基丁二酰亞胺（1-ethyl-3-（3’-dimethylaminopropyl）-3-ethyl-carbodiimide-N-hydroxysuccinimide，EDC-NHS）法偶聯(lián)QBs和PEAA抗體[24]：取20 mg QBs加入到5 mL 2-（N-嗎啉）甲磺酸水合物（2-（N-morpholino） ethanesulfonic acid hydrate，MES）緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.5）中，混勻后10 000 r/min離心30 min；收集沉淀，加入1 mL MES緩沖液重懸，分別加入40 μg EDC和50 μg Sulfo-NHS溶液，37 ℃振蕩反應(yīng)1 h后，10 000 r/min離心30 min；收集沉淀，加入1 mL 4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液重懸；將PEAA抗體加入到上述溶液中，37 ℃反應(yīng)2 h，然后加入含有10% BSA的PBS溶液封閉2 h，得到用QBs標(biāo)記的PEAA抗體產(chǎn)物，簡(jiǎn)稱QBs探針，4 ℃貯存，備用。

1.3.4 QBs熒光免疫標(biāo)記試紙條的組裝

QBs熒光免疫試紙條由5 個(gè)部分組成，分別為樣品墊、結(jié)合墊、硝化纖維素（nitrocellulose，NC）膜、吸水墊及聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板。將樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水墊依次黏貼在PVC底板上，將適當(dāng)濃度的PEAA和羊抗鼠二抗噴涂在NC膜上，分別作為檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），結(jié)合墊上包被QBs探針。

1.3.5 PEAA熒光免疫層析試紙條性能測(cè)試1.3.5.1 檢測(cè)范圍和檢測(cè)限測(cè)定

將PEAA標(biāo)準(zhǔn)品用陰性尿液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本研究中的熒光免疫層析試紙條和熒光免疫分析儀進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定10 次，取其平均值。以PEAA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以B/B0（B為不同質(zhì)量濃度PEAA測(cè)定所得T/C值，B0為質(zhì)量濃度0 μg/L時(shí)測(cè)得的T/C值）為縱坐標(biāo)，繪制擬合曲線。測(cè)定20 份陰性尿液，將“平均值+3 倍標(biāo)準(zhǔn)差”作為熒光免疫層析試紙條的檢測(cè)限[25]。

1.3.5.2 準(zhǔn)確度測(cè)定

通過(guò)添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定熒光免疫層析試紙條的準(zhǔn)確度[26-28]。取9 份陰性尿液樣本，加入質(zhì)量濃度分別為0.5、4.5、13.5 μg/L的PEAA，用熒光免疫層析試紙條和熒光免疫分析儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率的平均值和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），分析準(zhǔn)確度。樣品均重復(fù)測(cè)定10 次。

1.3.5.3 精密度測(cè)定

通過(guò)批內(nèi)和批間差來(lái)測(cè)試本研究中熒光免疫層析試紙條的精密度[29-31]。取陰性尿液樣本，加入不同量的PEAA標(biāo)準(zhǔn)品，配制成PEAA質(zhì)量濃度分別為4.5、13.5 μg/L的尿液，取同一批次熒光免疫層析試紙條10 條，分別對(duì)2 個(gè)質(zhì)量濃度的樣本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定；再取3 個(gè)不同批次熒光免疫層析試紙條各10 條，分別對(duì)2 個(gè)質(zhì)量濃度的樣本進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算CV平均值，分析批內(nèi)和批間的測(cè)定精密度。

1.3.5.4 特異性測(cè)定

在陰性尿液中分別添加克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、福莫特羅和PEAA，使其終質(zhì)量濃度為100 μg/L，用PEAA熒光免疫層析試紙條進(jìn)行測(cè)定。交叉反應(yīng)率按照公式（2）計(jì)算。

式中：ρ為實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/（μg/L）；ρ0為添加質(zhì)量濃度/（μg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin制圖軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[32-33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原合成鑒定

2.1.1 紫外掃描鑒定合成的人工抗原

將PEAA、BSA和偶聯(lián)物PEAA-BSA分別稀釋到同一質(zhì)量濃度，進(jìn)行紫外掃描。由圖2可知：BSA含有酪氨酸，決定了其特征吸收峰在278 nm波長(zhǎng)處；PEAA的特征吸收峰也在278 nm波長(zhǎng)處；基于疊加原理，二者的偶聯(lián)物PEAA-BSA的特征吸收峰也在278 nm波長(zhǎng)處，且在320 nm處有氮氮雙鍵（－N＝N－）特征吸收峰，且溶液顏色變?yōu)辄S色，表明偶聯(lián)成功。

2.1.2 偶聯(lián)比測(cè)定

2.1.2.1 PEAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

PEAA的最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，在220～525 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)PEAA倍比稀釋溶液進(jìn)行紫外掃描，得到PEAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.099 2x+0.020 5（r=0.996）。

2.1.2.2 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

BSA的最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，對(duì)BSA倍比稀釋后，分別在220～525 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，得到掃描曲線。經(jīng)測(cè)定，合成的PEAA-BSA質(zhì)量濃度為2.7 mg/mL，故BSA質(zhì)量濃度為0.278 8 mg/mL。帶入BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.141 0x+0.007 2（r=0.995），得到吸光度為0.046 5。

2.1.2.3 PEAA-BSA偶聯(lián)比計(jì)算

由圖3可知，重氮化法得到的PEAA-BSA的最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，對(duì)應(yīng)的吸光度為0.372，帶入PEAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出PEAA的質(zhì)量濃度為0.277 5 mg/mL，偶聯(lián)比=19.1∶1.0。Erlanger[34]認(rèn)為，PEAA和偶聯(lián)蛋白的結(jié)合比在8～25之間是比較適合的。

2.2 效價(jià)測(cè)定

表 1 間接ELISA法的效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 1 Titer determination by indirect ELISA

通過(guò)間接ELISA法測(cè)定小鼠的血清效價(jià)，評(píng)價(jià)抗體和抗原的特異性結(jié)合情況。由表1可知，采用人工合成的PEAA抗原免疫小鼠后，效價(jià)最高達(dá)1∶204 800，特異性良好。

2.3 PEAA熒光免疫層析試紙條的性能測(cè)定結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=－1.444 5x+2.495 2（R2=0.992 9），線性關(guān)系良好。20 份陰性尿液的測(cè)定結(jié)果平均值為0.426 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)差為0.02，因此尿液樣本的檢測(cè)限為0.496 μg/L。

2.3.2 準(zhǔn)確度

表 2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery of the method

由表2可知，測(cè)定回收率在90%～120%之間，CV在10%以內(nèi)，能滿足試劑盒的測(cè)定性能要求。

2.3.3 精密度

由表3可知，批內(nèi)CV均在4.0%～8.0%之間，小于10%，批間CV也在10%以內(nèi)，能滿足試劑盒的測(cè)定性能要求。

表 3 批內(nèi)及批間精密度測(cè)定結(jié)果Table 3 Intra-batch and inter-batch precision

2.3.4 特異性

表 4 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Cross-reactivity

由表4可知，各類似物的添加質(zhì)量濃度為100 μg/L時(shí)，用PEAA熒光免疫層析試紙條測(cè)定，PEAA與其他類似物的交叉反應(yīng)率均小于5.00%，表明PEAA熒光免疫層析試紙條的特異性良好。

3 結(jié) 論

PEAA已經(jīng)成為研究比較熱門(mén)的一種新型瘦肉精，建立檢測(cè)PEAA的快速檢測(cè)方法，有助于進(jìn)行基層檢測(cè)，保障肉類食品安全，從源頭把控食品質(zhì)量。熒光微球作為一種新型標(biāo)記物，能夠直接標(biāo)記抗體，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，因此在免疫層析技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。

抗原-抗體的結(jié)合特異性是實(shí)現(xiàn)免疫學(xué)檢測(cè)的關(guān)鍵，抗原決定簇決定了免疫產(chǎn)生抗體的基本特性，而制備的抗體效價(jià)對(duì)檢測(cè)方法靈敏度的影響十分重要。本研究通過(guò)重氮化法合成PEAA人工抗原，通過(guò)效價(jià)檢測(cè)，得到高效價(jià)PEAA抗體。在此基礎(chǔ)上以QBs為探針，成功將QBs與PEAA抗體偶聯(lián)，制備得到PEAA熒光免疫層析試紙條，該試紙條的檢測(cè)限為0.496 μg/L，靈敏度高于膠體金免疫層析法，且在熒光免疫法定量檢測(cè)尿液中的PEAA物質(zhì)中取得了突破性進(jìn)展，該試紙條的靈敏度和特異性都很好，能夠?yàn)槊庖呒夹g(shù)的開(kāi)發(fā)提供參考。