膿毒癥免疫治療的研究現(xiàn)狀

吳健鋒，裴 飛

0 引 言

膿毒癥是由宿主應對感染的免疫反應紊亂所引起的一個高度復雜的綜合征，也是急危重癥患者常見的致死病因之一。隨著拯救膿毒癥運動(Surviving Sepsis Campaign， SSC)指南在臨床診治中的廣泛開展[1]，1h內使用抗生素、早期液體復蘇和多種器官功能支持手段的規(guī)范應用已經(jīng)讓膿毒癥的短期病死率下降到20%左右[2-3]。在最新的膿毒癥3.0中，膿毒癥被重新定義為感染后宿主免疫反應失調導致的危及生命的器官功能衰竭[4]。近年來，隨著對于膿毒癥病理機制的深入研究，免疫抑制被認為是膿毒癥病理機制的中心環(huán)節(jié)[5]。目前，多種免疫藥物(胸腺肽α1、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等)的臨床研究初步表明免疫治療將會為膿毒癥治療帶來新希望。因此，文章從固有免疫抑制和適應性免疫抑制以及免疫調理聯(lián)合抗炎等方面介紹膿毒癥的治療。

1 固有免疫抑制治療

1.1干擾素γ干擾素γ(interferon-gama, IFN-γ)是由T淋巴細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞分泌的一種具有多種免疫功能的細胞因子。在體內，IFN-γ可以上調病原識別受體進而有利于抗原提呈細胞完成抗原信息的呈遞，抑制T淋巴細胞凋亡以及激活吞噬細胞的吞噬和殺菌能力，逆轉膿毒癥患者單核細胞表面人白細胞抗原(monocyte human leukocyte antigen，mHLA)DR的表達降低[6]。1991年， IFN-γ治療慢性肉芽腫患者的臨床研究就已經(jīng)開展[7]，這項研究的主要研究結果是IFN-γ(0.2 mg/mL，3次/周，12個月)或安慰劑治療后，慢性肉芽腫患者在1年的觀察時間窗內出現(xiàn)首次嚴重感染的時間。結果發(fā)現(xiàn)，與安慰劑組相比，IFN-γ治療組在研究窗內出現(xiàn)嚴重感染的患者更少(治療組14/63，安慰劑組30/65，P=0.002)。

隨后，有研究又發(fā)現(xiàn)IFN-γ還可用于治療膿毒癥患者。1997年，Docke等[8]首先在體外實驗中發(fā)現(xiàn)IFN-γ作用于經(jīng)LPS刺激的單核細胞可以增加腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的分泌增加和mHLA-DR表達的升高。近年來，一項隨機、雙盲、安慰劑對照的研究旨在觀察IFN-γ和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF)在治療膿毒癥中的療效[9]，結果發(fā)現(xiàn)在訪視點2，安慰劑組志愿者循環(huán)中促炎因子TNF-α和抗炎因子白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)的濃度分別下降了60%和39%，與對照組相比，IFN-γ組在第7天訪視期間的TNF-α濃度未顯著減弱，而IL-10卻下降的更加顯著。此外，IFN-γ組志愿者外周血中單核細胞表面mHLA-DR的表達也相應的從治療前的83%升高到98%。可見，IFN-γ可以通過刺激免疫細胞生成促炎因子，增強單核細胞的抗原提呈功能來逆轉膿毒癥中的免疫麻痹。盡管如此，目前的研究只能初步證明IFN-γ可能會在膿毒癥免疫抑制的治療中有較好的療效，仍需要更多的臨床研究來證實其療效。

1.2粒細胞巨噬細胞集落刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GM-CSF)是一種具有免疫刺激作用的生長因子，最初的研究認為它可以通過刺激骨髓前體細胞向粒細胞和巨噬細胞分化并形成集落。后來發(fā)現(xiàn)GM-CSF是一個多功能的細胞因子，可以通過誘導中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞的增殖和分化而發(fā)揮免疫調節(jié)作用[5]。

近年來，多項GM-CSF治療膿毒癥的臨床試驗相繼開展。Presneill 等[10]針對膿毒癥伴有呼吸功能障礙患者開展了一項小樣本的臨床研究，結果發(fā)現(xiàn)靜脈使用小劑量GM-SCF(3 mg/kg)治療后的患者，氧合指數(shù)較安慰劑組改善的更加明顯，肺泡內中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)目也進一步減少，但兩組患者在30 d生存率和器官功能衰竭數(shù)目的差異均并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Orozco等[11]也將GM-CSF用于治療非外傷腹腔感染的膿毒癥患者，結果顯示治療組的抗生素使用時間和平均住院時間較對照組明顯縮短，感染相關的并發(fā)癥也有所減少，但兩組在院內病死率上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2009年，Meisel等[12]采用mHLA-DR作為治療起始的評估指標，對嚴重膿毒癥患者進行GM-CSF免疫增強治療取得了成功，研究者將嚴重膿毒癥合并免疫麻痹狀態(tài)的患者(連續(xù)2 d mHLA-DR<8000 mAb/Cell)隨機分為GM-CSF治療組和等滲鹽水對照組，結果發(fā)現(xiàn)GM-CSF治療組在治療24 h后所有的患者mHLA-DR水平均明顯上升，而等滲鹽水對照組僅有15.8%的患者上升；同時，治療組APACHE-Ⅱ評分下降更快，呼吸機使用時間、住院時間和重癥監(jiān)護室(intensive care unit, ICU)入住時間也明顯縮短。2011年，Bo等[13]將12項G-CSF和GM-CSF治療膿毒癥患者的研究進行了Meta分析，共納入2380例膿毒癥患者，結果發(fā)現(xiàn)G-CSF和GM-CSF并不能改善膿毒癥患者的28 d生存率，這可能與入組患者膿毒癥發(fā)病時間不一、免疫狀態(tài)不同相關，分析發(fā)現(xiàn)GM-CSF可增加感染灶的清除?？梢?，過去臨床研究并未發(fā)現(xiàn)GM-CSF可改善膿毒癥患者的預后，但其在增強病灶清除率和降低繼發(fā)感染發(fā)生率上顯現(xiàn)出一定的作用。

目前，一項大樣本量的多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗 (NCT02361528)已經(jīng)開始。這一研究將選擇免疫麻痹的膿毒癥患者作為受試者，并且以28 d內ICU獲得性感染發(fā)生率作為這項研究的主要終點事件，該試驗旨在證實GM-CSF對于感染病灶的清除和減少繼發(fā)感染的療效，其結果將會成為GM-CSF是否可以使膿毒癥患者獲益提供更加豐富的臨床證據(jù)。

1.3免疫球蛋白靜脈免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin， IVIG)可通過中和細菌內毒素和外毒素，刺激血清殺菌活性和增加抗炎介質來調節(jié)膿毒癥的免疫反應。2007年的SBITS研究是第一項大樣本IVIG治療膿毒癥的臨床研究[14]，該研究隨機將患者分成安慰劑對照組(n=303)和IVIG治療組(n=321)，IVIG組在入組當天給予IgG 0.6 g/kg，次日則給予0.3 g/kg，結果發(fā)現(xiàn)兩組患者的28 d病死率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[15]。2008年，ESSICS研究納入了218例心臟外科術后嚴重炎癥反應綜合征的患者(n=218)，研究者隨機將患者分成白蛋白對照組(0.1%白蛋白)和IVIG治療組(10%IgG)，白蛋白對照組在入組當天給予6 mg/kg的白蛋白，在入組后第1天給予3 mg/kg的白蛋白，而治療組的給藥同SBTIS研究，研究最終結果顯示兩組患者的28 d死亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這兩項早期研究的結果均證明IVIG并不能改善膿毒癥患者的生存預后。隨后，INSTINCT研究在皮膚軟組織感染患者中同樣發(fā)現(xiàn)靜脈IVIG并不能降低患者180 d病死率[16]。Iizuka等[17]通過一項大樣本的回顧性配對研究也證明使用低劑量IgG治療膿毒癥和膿毒性休克患者并不能改善患者病死率。多項臨床研究均未在IVIG治療膿毒癥中證明其療效。

接著，有研究在使用IgG的基礎上加用IgM進行免疫球蛋白聯(lián)合治療。Hentrich等[18]在CCM上發(fā)表的一項關于靜脈使用富含IgG、IgM以及IgA(IVIGMA)的免疫球蛋白組合治療膿毒癥患者的研究。該研究共納入了211例化療后伴有中性粒細胞減少的膿毒癥患者。治療組患者在72 h內接受1300 mL的IVIGMA治療，對照組則在72 h內接受等體積的5%白蛋白，結果發(fā)現(xiàn)兩組間的28 d病死率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2013年，Cochrane對IVIG和免疫球蛋白IgG聯(lián)合IgM治療膿毒癥進行了薈萃分析，在10項IVIG治療的研究中共納入了1430例患者，結果發(fā)現(xiàn)IVIG組患者在28～180 d的病死率為29.6%(RR：0.81， 95%CI：0.70～0.93)，安慰劑組為36.5%。IVIGM的研究中(n=528例)，IVIGM組28～60 d的病死率為24.7%(RR：0.66， 95%CI：0.51～0.85)，安慰劑組為37.5%。近期，Laupland等[19]發(fā)現(xiàn)IVIG可降低患者病死率(OR：0.66， 95% CI：0.53～0.83)，進行亞組分析IVIG(OR：0.96，95% CI：0.71～1.3)卻不能得到相同的結論。

總之，目前關于IVIG和IVIGM的研究大多數(shù)樣本量偏小、偏倚風險較高，幾個大型的RCT研究都未能證明免疫球蛋白可改善膿毒癥患者的病死率。因此，SSC指南不推薦膿毒癥患者使用免疫球蛋白；而IVIGM需要更多高質量的臨床研究來進一步證明它在膿毒癥治療中的療效。

IFN-γ作為一種細胞因子可以改善膿毒癥患者的免疫抑制，但是需要特別注意的是該藥有可能誘導過度的炎癥反應，因此在未來臨床上的應用可能受到嚴格的限制。GM-CSF可以通過刺激粒細胞和單核-巨噬細胞的活化而改善膿毒癥固有免疫抑制，對于本身已有粒細胞和單核細胞數(shù)目增多的大多數(shù)膿毒癥患者是否適用仍有待進一步研究。另外，IVIG的使用時機、劑量和療程仍需探討。

2 適應性免疫抑制治療

2.1IL-7膿毒癥的病理生理特點之一就是淋巴細胞的凋亡和CD4+和CD8+T淋巴細胞的耗竭。IL-7作為一種抗細胞凋亡的常見γ鏈細胞因子，對淋巴細胞的增殖和存活至關重要[20]。它可以誘導活化和非活化T淋巴細胞的增殖，抑制其凋亡，從而逆轉膿毒癥病程中淋巴細胞的減少[20-21]。IL-7調節(jié)膿毒癥誘導的免疫抑制的機制包括：誘導T淋巴細胞增殖、抑制淋巴細胞凋亡以及增加黏附分子地表達以促使免疫細胞更好地游走和趨化。因此，人們開始探究IL-7在改善膿毒癥免疫抑制中的治療作用。臨床前研究發(fā)現(xiàn)IL-7對嚴重的膿毒癥小鼠有明顯的保護性作用[22-23]。對膿毒癥患者的T淋巴細胞進行體外IL-7治療后發(fā)現(xiàn)，IL-7促進T淋巴細胞的增殖和IFN-γ的分泌，間接地證明了IL-7能夠逆轉人類膿毒癥中淋巴細胞的功能紊亂[21]。

近期，全球第一項驗證IL-7治療膿毒癥患者療效的臨床試驗已經(jīng)完成并正式發(fā)表[24]，該研究納入了法國和美國的27名膿毒性休克和嚴重淋巴細胞減少患者。這些患者隨機接受重組人IL-7(CYT107)或安慰劑治療4周，研究的主要目的是確定CYT107在膿毒癥治療中逆轉淋巴細胞減少的能力及其安全性。結果發(fā)現(xiàn)CYT107耐受性良好，沒有誘導細胞因子風暴或炎癥或器官功能障礙惡化；并且CYT107治療后絕對淋巴細胞計數(shù)和循環(huán)中CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)目較基礎狀態(tài)增加3～4倍，并且可以在治療后持續(xù)數(shù)周。此外，CYT107還可增加T淋巴細胞增殖和活化能力?？梢?，通過恢復適應性免疫，逆轉CD4+和CD8+T淋巴細胞的耗竭，CYT107為膿毒癥的治療帶來了新的希望。在此基礎上，隨后必然會有更大樣本量的多中心臨床研究來進一步驗證IL-7在治療膿毒癥中的療效，這也將會更進一步地推進適應性免疫缺陷免疫輔助治療在膿毒癥中的深入研究。

2.2胸腺肽α1胸腺肽α1是一種天然分泌的小分子物質，主要由胸腺分泌。1972年，Goldstein等[25]首次從胸腺Ⅴ肽提取出胸腺肽α1并對其特征進行了描述。胸腺肽α1作為調節(jié)因子在固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)中均可發(fā)揮作用。它不僅可以活化DC細胞，增強Th1細胞的抗真菌作用，而且能夠激活巨噬細胞胞內MAPK轉錄信號通路[26]，增強巨噬細胞的殺菌能力。同時，胸腺肽α1還可增加IL-12、IL-2、IFN-α和IFN-γ的釋放而具有抗菌作用，并且還能增加IL-10分泌來控制炎癥反應。

目前，胸腺肽α1被用于治療與免疫紊亂有關的疾病，包括乙肝病毒感染、某些癌癥以及作為疫苗強化劑。近年來中國已經(jīng)進行了多項關于胸腺肽α1治療膿毒癥的臨床研究[27]。2007年，一項納入了42例膿毒癥患者的隨機對照研究發(fā)現(xiàn)[28]，使用胸腺肽α1治療(1.6 mg,2次/d,持續(xù)7 d)的膿毒癥患者28 d病死率較對照組明顯下降(P<0.01)，并且治療組患者的機械通氣時間和住ICU時間均得到減少。樊舉兵等[29]納入120例老年膿毒癥患者(≥60歲)的研究同樣也發(fā)現(xiàn)胸腺肽α1治療可以改善膿毒癥患者的院內病死率。2013年，吳健鋒等[30]完成了一項納入361例膿毒癥患者的多中心隨機對照研究(ETASS研究)，旨在探討胸腺肽α1在治療膿毒癥中的療效和安全性，所有患者被隨機分配至對照組(n=180)和胸腺肽α1組(n=181)，治療組接受7 d療程的治療(1.6 mg 胸腺肽α1，12 h/次，持續(xù)5 d；接著，1.6 mg 胸腺肽α11次/d，持續(xù)2 d)，結果發(fā)現(xiàn)胸腺肽α1組和對照組在28 d內的全因死亡率分別是26.0%和35.0%(P<0.05)；與對照組相比，胸腺肽α1治療組患者的mHLA-DR改善更加明顯，結果提示胸腺肽α1與傳統(tǒng)膿毒癥的治療策略聯(lián)合應用可能有效地改善嚴重膿毒癥人群的臨床結局。一篇納入19個隨機對照臨床研究的薈萃分析也提示胸腺肽α1可以改善膿毒癥患者的預后，但納入分析的研究樣本量過少，且多數(shù)研究并未涉及到病死率的數(shù)據(jù)。因此，我們仍需要大樣本的多中心研究來進一步驗證其在治療膿毒癥中的療效。

近期，我們正在開展一項胸腺肽α1治療膿毒癥的多中心隨機雙盲對照研究(NCT02867267)，目前正在募集受試者，預計納入超過1000例膿毒癥患者。該研究不僅基于前期研究結果以受試者年齡進行分層，而且以mHLA-DR, Treg作為評估患者免疫狀態(tài)的指標，希望通過大樣本的臨床研究為胸腺肽α1膿毒癥的治療提供更加充分的臨床證據(jù)。

2.3抗PD-L1抗體抗PD-L1(programmed death ligand 1)抗體和抗PD-L1抗體作為抑制性免疫檢查點的抗體能夠恢復T淋巴細胞的功能，因而被認為是膿毒癥的潛在治療方案。目前PD-1和PD-L1的單克隆抗體已被開發(fā)作為癌癥的治療手段并允許進入臨床。Huang等[31]在2009年的研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞表面PD-1的表達與免疫功能紊亂有關，當阻斷PD-1的表達后，膿毒癥小鼠的病死率可得到明顯改善。Zhang等[32]的研究發(fā)現(xiàn)使用抗PD-L1抗體阻斷盲腸結扎穿孔小鼠的PD-L1的作用后，小鼠淋巴細胞凋亡減少，單核細胞功能紊亂也得到逆轉，并且膿毒癥休克患者體內PD-1和PD-L1的表達升高與膿毒癥的病死率、繼發(fā)感染發(fā)生率呈正相關。Chang等[33]利用CLP方法給膿毒癥小鼠造模后，3 d再給予尾靜脈注射白色念珠菌，制作膿毒癥二次打擊模型。造模成功48 h后使用抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1通路，結果發(fā)現(xiàn)二次打擊的膿毒癥小鼠死亡率下降[33]，隨后，Chang等[33]又利用抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體在體外作用于膿毒癥患者的外周血單個核細胞發(fā)現(xiàn)了與膿毒癥小鼠模型中相同的結果。可見，膿毒癥患者體內PD-1/PD-L1的激活可導致T淋巴細胞凋亡增加， Treg細胞比例增加。因此，阻斷PD-1/PD-L1通路將有助于降低繼發(fā)感染發(fā)生率，改善膿毒癥患者預后。近期，抗PD-L1抗體治療膿毒癥的Ⅰ期臨床試驗(NCT02576457)已經(jīng)結束，該研究結果將會證明抗PD-L1抗體在治療膿毒癥中的初步療效和安全性。

IL-7、胸腺肽α1均可以通過刺激淋巴細胞激活改善膿毒癥適應性免疫抑制，而抗PD-L1抗體通過拮抗PD-1/PD-L1通路同樣也可以有助于逆轉T淋巴細胞免疫抑制。目前幾項正在進行的大樣本臨床研究將會進一步驗證這些適應性免疫調理藥物的療效。

3 免疫調理聯(lián)合抗炎治療

膿毒癥的全身炎癥反應和細胞免疫抑制并不是獨立的兩個部分，在很多膿毒癥患者體內它們會同時存在。近年來，持續(xù)炎癥反應、免疫抑制和分解代謝綜合征(persistent inflammation, immunosuppression, and catabolic syndrome, PICS)作為一種新的概念被大家熟知[34]。PICS的臨床診斷主要包括以下幾個方面[34-35]：①住院時間延長超過14 d；②持續(xù)炎癥反應：C反應蛋白持續(xù)>150 μg/dL；③免疫抑制：淋巴細胞總數(shù)<0.8×109/L；④分解代謝增加：住院期間體重下降超過10%或者體重指數(shù)<18，肌酐升高指數(shù)<80%，視黃醇結合蛋白<10 μg/dL，白蛋白<3 mg/dL,前白蛋白<30 mg/dL等。PICS概念的提出讓我們看到單獨進行抗炎治療或者免疫調理治療可能是不恰當?shù)摹?/p>

近年來，我國學者率先提出同時進行抗炎與細胞免疫調理治療或許有利于改善膿毒癥患者的預后。2007年，中國膿毒癥免疫調理治療臨床研究協(xié)作組完成一項聯(lián)合烏司他丁和胸腺肽α1治療膿毒癥的多中心隨機雙盲對照研究[36]，該試驗分為兩個階段，共納入433例膿毒癥患者。第一階段(n=91)治療組患者接受烏司他丁10萬U/次，3次/d,1.6 mg胸腺肽α1，1次/d；第二階段(n=342)治療組患者接受烏司他丁(20萬U/次，1次/d)和1.6 mg胸腺肽α1(2次/d)。結果顯示第一階段兩組間28 d病死率未見明顯差異，而第二階段發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療可顯著降低膿毒癥患者28 d病死率(P<0.01)和90 d病死率(P<0.01)。同時還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療可降低APACHEⅡ評分和增加m HLA-DR的表達。2009年，兩項臨床研究也得到同樣的結果，Chen等[37]研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合烏司他丁和胸腺肽α1治療的患者(n=59)較對照組(n=55)改善膿毒癥患者28 d生存率(P>0.05)、60 d生存率(P<0.05)和90 d生存率(P<0.05)。蘇磊等[38]研究顯示治療組(n=242)28 d病死率較對照組(n=114)明顯降低(P<0.05)。2016年，F(xiàn)eng等[39]分析顯示，烏司他丁聯(lián)合胸腺肽α1治療可以降低膿毒癥患者28 d病死率(P<0.01)和90 d病死率(P<0.01)。可見，免疫調理聯(lián)合抗炎治療在膿毒癥患者中初步獲得成功。

膿毒癥有可能同時存在持續(xù)炎癥反應和免疫抑制，免疫調理聯(lián)合抗炎治療初步給出了解決這一復雜免疫狀態(tài)的治療方案。但是如何識別和確認這一復雜的免疫紊亂狀況是臨床上一個巨大的挑戰(zhàn)。

4 展 望

隨著近年來免疫治療研究的迅猛發(fā)展，可供選擇的免疫治療藥物也將會越來越多，關于膿毒癥免疫治療的臨床研究也將隨之增加。從目前的研究結果可以發(fā)現(xiàn)不論是免疫調理還是聯(lián)合的抗炎治療都有可能逆轉膿毒癥免疫抑制，改善預后。因此，免疫調理治療為膿毒癥治療帶來新的曙光。但是考慮到膿毒癥本身高度異質性的特點，對于所有膿毒癥患者都進行免疫治療可能是不可取的，我們需要對不同的患者進行個體化的免疫調理治療。隨著“組學”等技術的應用和發(fā)展，我們未來可以實現(xiàn)對膿毒癥患者進行分型或分期。因此，個體化治療將會成為未來膿毒癥免疫治療的必經(jīng)之路。