野木瓜果酒香氣成分提取方法的比較

劉小雨，李科，韋廣鑫，張惟廣

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

野木瓜(Stauntoniachinensis)別稱皺皮木瓜、鐵腳梨等，為我國特有果木之一，屬薔薇科灌木叢植物，享有“百益之果”的美稱[1]，富含氨基酸、多種維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)素，以及黃酮、皂苷類、原花青素、有機酸和酶等生理活性物質(zhì)。但其糖酸比低，口感酸澀堅硬，不宜作為普通水果食用。野木瓜果酒是以新鮮野木瓜為原料，人工添加釀酒酵母釀制而成，其色澤明亮、酸甜適口、香氣醇厚，且保留了野木瓜的營養(yǎng)成分。

香氣是評價野木瓜果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)。目前，果酒香氣的研究主要集中在具有揮發(fā)性、半揮發(fā)性的芳香物質(zhì)上，而芳香物質(zhì)的提取是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，果酒香氣的定性與定量分析結(jié)果與其有直接的關(guān)系。國內(nèi)外大量的基礎(chǔ)研究[2-5]豐富了果酒的香氣提取方法，但同時采用不同方法對果酒香氣進行提取并比較不同方法間的差異鮮見報道。

香氣提取方法主要有同時蒸餾法(simultaneous distillation extraction,SDE)、space-solid phase micro法和MMSE法，SDE法是通過同時加熱樣品與有機溶劑至沸騰實現(xiàn)蒸餾與提取同時進行濃縮香氣的方法；SPME法是通過具有吸附揮發(fā)性物質(zhì)能力的纖維頭來富集樣品的香氣物質(zhì)；MMSE法是利用兼具硅膠、活性炭和十八烷基硅烷鍵合硅膠(ostade-cylsilane, ODS)基團的復(fù)合吸附劑來吸附樣品香氣物質(zhì)。因此，本試驗采用上述3種方法分別對野木瓜果酒風(fēng)味物質(zhì)進行提取，用GC-MS結(jié)合保留指數(shù)進行定性分析，選出適宜于野木瓜果酒香氣物質(zhì)的提取方法，并初步確定野木瓜果酒的主體香氣成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野木瓜：2017年10月份采收于重慶市綦江區(qū)安琪SY釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；KHCO3、K2S2O5、NaCl、CH2Cl2、Na2SO4：分析純，成都科龍化工試劑廠；果膠酶：酶活≥500 000 U/g，成都科龍化工試劑廠；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)品(C3～C9、C10～C25)：色譜純，百靈威科技有限公司；2-辛醇：色譜純，sigma公司；無水乙醇：色譜純，成都科龍化工試劑廠；酵母營養(yǎng)添加物：法國LAFFORT公司；蔗糖：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

榨汁機(HR-2003)，飛利浦中國投資公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LHS-50SC)，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；酸度計(PB-10)，德國賽多利斯集團；紫外可見分光光度計(UV1000)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；手持式糖度計(WZS-32)，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；氮吹儀(JHD-002)，上海極恒實業(yè)有限公司；固相萃取整體捕集劑(MonoTrap DCC18)、聯(lián)用儀(QP2010)，日本島津公司；手動進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國supelco公司；同時蒸餾萃取裝置，北碚區(qū)特種玻璃儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 野木瓜果酒的釀制

挑選成熟無霉變的野木瓜，清洗，去皮籽，切碎，按1∶1(質(zhì)量比)加水打漿，制成野木瓜汁，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%果膠酶，攪拌均勻，45 ℃酶解3～4 h，再加入偏重亞硫酸鉀，1 L酒液中含100 mg SO2。添加蔗糖、KHCO3，調(diào)整野木瓜汁外觀糖度為22 °Brix，pH值為3.50，準(zhǔn)備接種發(fā)酵。取上述野木瓜汁800 mL置于1 000 mL發(fā)酵錐形瓶中，控制發(fā)酵溫度為22 ℃，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的安琪SY活性干酵母粉，同時加入0.3 g/L酵母營養(yǎng)添加物。發(fā)酵至外觀糖度不變，認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。分離酵母，密封陰涼處貯藏酒液。

1.3.2 香氣提取方法

1.3.2.1 同時蒸餾法

取200 mL野木瓜果酒置于500 mL平底燒瓶中，連入SDE裝置的樣品瓶端，用電爐加熱至沸。裝置另一端接入裝有50 mL重蒸二氯甲烷的圓底燒瓶，40 ℃水浴加熱。萃取過程中，由于水與二氯甲烷不相混溶，在U型管中形成明顯的分界線，且不斷流向兩側(cè)燒瓶。連續(xù)萃取2 h后，將萃取液置于冰箱冷凍室24 h。取出并除去冰塊，用無水硫酸鈉脫水處理后，氮吹濃縮至1 mL，取0.5 μL濃縮液進樣分析。參照袁仲等優(yōu)化后的方法修改[6]。

1.3.2.2 固相微萃取法

取8 mL酒液放入20 mL萃取瓶中，加入2 g NaCl促進香氣的揮發(fā)。用聚四氟乙烯隔墊密封，于45 ℃下水浴平衡15 min后，插入活化好了的萃取頭，頂空吸附40 min后，插入到GC進樣口解析5 min。參照任曉宇等優(yōu)化后的方法修改[7]。

1.3.2.3 固相萃取整體捕集劑法

取8 mL酒液于20 mL萃取瓶中。將MonoTrap的中間孔套入頂空桿，并穿過瓶蓋，使MonoTrap DCC18懸掛于樣品上方，60 ℃水浴90 min。取出吸附劑，置于另一萃取小瓶中，加入600 μL重蒸二氯甲烷，超聲波提取5 min后，氮氣吹掃濃縮至數(shù)微升，取1 μL進樣。參照高韶婷等優(yōu)化的方法修改[8]。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度為230 ℃；升溫程序為35 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至55 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持4 min。載氣為氦氣，流速1 mL/min，壓力47.7 kPa。分流比為5∶1。

MS條件：電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；采集模式；全掃描(Scan)；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～450；掃描速率769 u/s。參照田亮[9]方法修改。

1.3.4 香氣成分定性與定量

由GC-MS分析所得的質(zhì)譜圖經(jīng)計算機自帶的NIST 08譜庫檢索，并結(jié)合保留指數(shù)進行定性。

保留指數(shù)的測定：將正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品C3～C9、C10～C25溶于甲醇，配制適宜濃度，按條件1.3.2.2進樣，得標(biāo)準(zhǔn)譜圖。取其保留時間，按照程序升溫計算公式計算保留指數(shù)，并與譜庫自帶物質(zhì)保留指數(shù)進行對照。

(1)

式中:tx、tn和tn+1分別為被分析組分、碳原子數(shù)處于n和n+1的正構(gòu)烷烴(tn

半定量法確定各香氣成分在野木瓜果酒中的含量，具體操作方法如下：取20 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于8 mL酒液中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在混合體系中的濃度為1 225.4 μg/L，以峰面積歸一化法，按照下列公式計算各香氣物質(zhì)含量：

(2)

式中，校正因子f計為1。樣品重復(fù)3次，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.5 主體香氣成分的確定

氣味活化值(odor activity value，OAV)是指氣味物質(zhì)濃度與其閾值的比值，它可以反映各香氣物質(zhì)對野木瓜果酒整體香氣的貢獻(xiàn)情況，計算公式為:

OAV=cx/OTx

式中：cx，化合物X在飲料酒中的含量；OTX，化合物X在飲料酒中的閾值。一般認(rèn)為，OAV>1的成分為樣品主體呈香化合物，OAV值越大，對香氣貢獻(xiàn)越顯著[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種萃取方法提取野木瓜果酒揮發(fā)性成分的比較

質(zhì)譜結(jié)合保留指數(shù)對野木瓜果酒中的風(fēng)味物質(zhì)進行定性分析，發(fā)現(xiàn)3種萃取方法所得風(fēng)味物質(zhì)差異明顯，檢測的具體風(fēng)味物質(zhì)及相對含量如表1所示。

3種萃取風(fēng)味物質(zhì)的方法共檢測出75種風(fēng)味物質(zhì)，主要有醇類、酯類、酸類、醛酮類、芳香族類、萜類以及其他化合物。其中，SDE法檢測出36種風(fēng)味物質(zhì)，SPME法檢測出42種風(fēng)味物質(zhì)，MMSE法檢測出36種風(fēng)味物質(zhì)。3種方法共同檢出異戊醇、正己醇、苯乙醇、乙酸異戊酯、3-羥基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯、對甲基苯乙酮、丁香酚等物質(zhì)。

表1 SDE、SPME、MMSE萃取野木瓜果酒風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Aroma components of Stauntonia chinensis wine extracted by SDE、SPME、MMSE

續(xù)表1

編號化合物名稱分子式相對含量%SDESPMEMMSE譜庫保留指數(shù)a實驗保留指數(shù)b鑒定方式3糠醛FurfuralC5H4O21.94NDND831855MS&RI4苯甲醛BenzaldehydeC7H6O0.26ND0.22982963MS&RI5對甲基苯乙酮4-MethyacetophenoneC9H10O0.1918.871.171 1421 153MS&RI6癸醛decanolC10H20OND0.14ND1 2041 204MS&RI7α,β-雙氫-β-紫羅蘭酮α,β-Dihydro-β-iononeC13H22OND0.08ND1 4491 426MS&RI83,5-二羥基-4,4-二甲基-2-丙酰-2,5-環(huán)己二烯-1-酮3,5-Di-hydroxy-4,4-dimethyl-2-propionyl-2,5-cyclohexadien-1-oneC11H14O4NDND0.511 6731 680MS&RI9β-紫羅蘭酮β-IononeC13H20OND0.07ND1 4571 472MS&RI10十五醛PentadecanalC15H30ONDND0.411 7011 707MS&RI11正十八醛OctadecanalC18H36ONDND0.571 9992 009MS&RI萜類化合物1D-檸檬烯D-LimoneneC10H16ND0.33ND1 0181 025MS&RI2芳樟醇β-LinaloolC10H18OND0.21ND1 0821 097MS&RI3α-松油醇α-TerpineolC10H18O0.47NDND1 1431 195MS&RI4α-法呢烯α-FarneseneC15H24ND0.10ND1 4581 498MS&RI芳香族化合物1甲苯TolueneC7H80.30ND1.16794774MS&RI2苯乙烯StyreneC8H8ND1.58ND883894MS&RI3乙基苯EthylenzeneC8H100.07ND0.26893865MS&RI44-乙氧基苯乙烯4-EthoxystyreneC10H12O0.37NDND1 1721 211MS52-甲基-4-乙基苯酚2-Methyl-4-ethylphenolC9H12OND0.36ND1 2271 240MS&RI64-乙烯基-2-甲氧基苯酚2-Methoxy-4-vinylphenolC9H10O20.40NDND1 2931 305MS&RI7丁子香酚EugenolC10H12O22.601.744.801 3921 360MS&RI83,5-二甲基-1-芐基苯Benzene,3,5-dimethyl-1-(phenylmeth-yl)-C15H16NDND1.211 6931 670MS&RI其他化合物11-十六烯HexadecaneC16H34NDND0.841 6121 594MS&RI2十八烯1-OctadeceneC18H36NDND0.521 8011 785MS&RI3正十八烷OctadecaneC18H38NDND0.891 8101 797MS&RI4正十九烷NonadecaneC19H403.09ND0.501 9101 859MS54-甲基十九烷4-methyl- NonadecaneC20H420.27NDND1 9451 999MS6正二十烷EicosaneC20H42NDND0.912 0091 989MS&RI7棕櫚酰胺HexadecanamideC16H33NO1.99NDND2 0212 043MS&RI82-甲基-二十烷2-methyl- eicosaneC21H44NDND0.612 0452 058MS&RI9正二十一烷HeneicosaneC21H443.50ND0.832 1092 099MS&RI

注：a表示NIST 08譜庫中各物質(zhì)的保留指數(shù)；b表示各物質(zhì)流經(jīng)色譜柱DB-5MS分離計算保留指數(shù)；MS表示質(zhì)譜定性，RI表示保留指數(shù)定性；“ND”表示未檢出。

為了更直觀討論3種方法提取醇類、酯類、酸類、醛酮類、芳香族類、萜類以及其他化合物的情況，根據(jù)表1，作出各類物質(zhì)種類數(shù)量圖(圖1)，各類物質(zhì)總相對含量圖(圖2)。

圖1 SDE、SPME和MMSE萃取香氣物質(zhì)種類數(shù)量比較
Fig.1 The comparation of the quantity of aroma compounds
by SDE，SPME，MMSE

圖2 SDE、SPME和MMSE萃取香氣物質(zhì)相對含量比較
Fig.2 The comparation of the relative content of aroma
compounds by SDE，SPME,MMSE

醇類物質(zhì)是果酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)，包括乙醇、甘油(由于設(shè)置溶劑延遲，未檢出)和高級醇，高級醇賦予果酒強烈的溶劑和雜醇油香氣[12]。醇類物質(zhì)提取方面，SDE法與MMSE法提取醇類物質(zhì)總相對含量較高，分別達(dá)到71.27%和70.89%，SPME法提取的醇類物質(zhì)相對含量為20.37%(圖2)。3種方法均能提取異戊醇、正己醇和苯乙醇，其中，異戊醇和苯乙醇相對含量較高，異戊醇普遍存在于果酒中，其具有苦杏仁味；苯乙醇是一種具有玫瑰花香氣的化合物，來源于酵母代謝，是果酒主要特征香氣成分[13-15]。此外還檢出了2-甲基丁醇、正己醇、順-3-己烯醇、正庚醇、苯甲醇、2-己基-1-癸醇、順式-4-癸烯-1-醇、正癸醇、月桂醇等。

酯類化合物是酵母進行酒精發(fā)酵時的次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)形成途徑的不同分為乙酸酯類化合物和乙酯類化合物。一般而言，果酒中酯類化合物閾值普遍較低，對于果酒整體風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)顯著。酯類物質(zhì)提取方面，SPME法具有明顯優(yōu)勢，其提取出24種酯類物質(zhì)，占總揮發(fā)性化合物的55.96%。SDE法和MMSE法均提取出11種酯類物質(zhì)，占比分別為4.94%、10.41%。究其原因，可能是SPME提取香氣條件溫和，極大地提取了低沸點的酯類化合物。而另外兩法提取時間較長，酯類物質(zhì)可能發(fā)生分解或者氮吹過程有損耗，導(dǎo)致酯類物質(zhì)檢出較少。從檢出酯類物質(zhì)相對含量來說，MMSE法優(yōu)于SDE法。3種方法均檢出乙酸異戊酯、3-羥基丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯[16-17]。另外，SPME法檢測出的苯甲酸乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯占比也較高，它們可能為果酒重要呈香物質(zhì)。

酸類化合物為發(fā)酵副產(chǎn)物，是果酒酸臭氣味的主要來源，文中共檢出6種酸類物質(zhì)，包括2-羥基-2-甲基丁酸、己酸、3-巰基丙酸、辛酸、棕櫚酸、油酸。SDE法檢出酸的碳鏈較長，如棕櫚酸、油酸，而SPME法和MMSE法檢測均為短鏈酸，如己酸和辛酸。SDE法對中等高沸點的成分萃取回收率較高，而SPME法和MMSE法則對低沸點的成分比較敏感[18]。

醛酮類化合物的產(chǎn)生一般源于醇的氧化或是酸的還原，也有部分來源于糖代謝，它們是果酒重要的呈味物質(zhì)[19]。MMSE法提取醛酮類物質(zhì)種類最多，為6種，SPME法和SDE法均提取出4種。其中，3種方法均提取出對甲基苯乙酮，SPME法提取該物質(zhì)占比達(dá)到18.87%。對甲基苯乙酮具有山楂子花的芳香，并伴隨著紫苜蓿、蜂蜜、草莓香氣，果酒香氣研究中鮮有報道該物質(zhì)，可能為野木瓜果酒的特征香氣物質(zhì)。

萜類化合物主要來源于原料本身，為植物體內(nèi)乙酰輔酶CoA合成的次級代謝產(chǎn)物，一般以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)存在于果實中[20]。果實經(jīng)酵母發(fā)酵之后，萜類化合物占比大大減少，僅為0.47%～0.65%(表1)。本文3種方法共檢出4種萜類化合物，分別為D-檸檬烯、芳樟醇、α-松油醇、α-法呢烯。

芳香族化合物的提取方面SDE法和MMSE法檢出率較高，可能與這2種方法都使用有機溶劑提取有關(guān)。另外，3種方法均檢出丁香酚，相對含量檢出為1.74%～4.80%，其具有典型丁香香氣，且閾值很低，為6 μg/L[21]，或為野木瓜果酒重要呈香物質(zhì)。

3種方法共檢出其他化合物共9種，主要為烷烴類化合物，此類物質(zhì)不是野木瓜果酒的呈香物質(zhì)，MMSE法提取該類物質(zhì)最多，可能與其架構(gòu)含有活性炭有關(guān)。綜合比較SDE法、SPME法和MMSE法提取野木瓜果酒香氣成分的提取特性，發(fā)現(xiàn)SDE法對大分子量、高沸點的醇類、酸類提取效果較好，其提取酯類物質(zhì)能力較差；SPME法提取低沸點的醇類、酯類、醛酮類化合物效果最優(yōu)。MMSE法對醇類、酯類、醛酮類、芳香族類化合物提取效果優(yōu)良，但對酯類物質(zhì)提取效果不及SPME。SDE法由于提取風(fēng)味物質(zhì)時，加熱溫度過高，易產(chǎn)生衍生物，有香氣失真的可能。SPME法和MMSE法提取樣品均符合簡便、安全、溶劑少、效率高等特點，對于果酒風(fēng)味物質(zhì)的提取具有一定的互補性。MMSE作為一種新型的香氣富集劑，還需進一步研究探討。

就野木瓜果酒而言，SPME法提取的風(fēng)味物質(zhì)較多，且能較大程度地提取果酒香氣形成的主要物質(zhì)——醇酯類物質(zhì)[22-24]。另外，該法簡單、清潔、高效，適宜用來對野木瓜果酒香氣進行提取研究。

2.2 野木瓜果酒主體香氣成分的確定

為了獲得野木瓜果酒的主體香氣成分，采用SPME法對野木瓜果酒揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分進行提取，并定性定量分析，計算各香氣成分的含量。查詢文獻(xiàn)中各香氣成分在果酒中的閾值，計算活化值，從而確定野木瓜果酒的主體香氣成分。

由表2中可知，乙酸異戊酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、癸醛、芳樟醇、丁香酚的OAV值大于1，可認(rèn)為它們?yōu)橐澳竟瞎浦黧w香氣成分。另外，對甲基苯乙酮含量較高(2 728.21±218.15 μg/L)，具有山楂子花芳香，閾值未知，可能為野木瓜果酒的重要呈香成分。異戊醇、苯乙醇、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、辛酸、癸酸等OAV值在0.1～1之間，對果酒整體香氣形成也有一定影響。

表2 野木瓜果酒主體香氣成分的含量、閾值、香氣值及香氣描述Table 2 Concentrtions, odour thresholds, OAV, odordescription of the main compounds in Stauntoniachinensis wine

注：表中僅列出OAV>1的香氣成分。

3 結(jié)論與討論

本文通過SDE法、SPME法和MMSE法檢測出野木瓜果酒風(fēng)味物質(zhì)75種，主要有醇類、酯類、酸類、醛酮類、芳香族類、萜類以及其他化合物，認(rèn)為覆蓋了野木瓜果酒的基本風(fēng)味物質(zhì)。比較SDE法、SPME法和MMSE法提取野木瓜果酒風(fēng)味物質(zhì)的特性，發(fā)現(xiàn)SDE法對大分子量、高沸點的醇類、酸類提取效果較好，其提取酯類物質(zhì)能力較差；SPME法提取低沸點的醇類、酯類、醛酮類效果最優(yōu)。MMSE法對醇類、酯類、醛酮類、芳香族類化合物提取效果優(yōu)良，但對酯類物質(zhì)提取效果不及SPME。就野木瓜果酒而言，選擇SPME法即可滿足香氣提取研究要求。依據(jù)香氣活化值，確定野木瓜果酒主體風(fēng)味成分為乙酸異戊酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、癸醛、芳樟醇、丁香酚。