窖泥中高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類功能菌的篩選與鑒定

周金虎，李良，方尚玲，董孝元，張超，陳茂彬*

1(發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北工業(yè)大學(xué)),湖北 武漢,430068) 2(黃鶴樓酒業(yè)(咸寧)有限公司,湖北 咸寧,437000)3(工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 武漢,430068) 4(工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢,430068)

白酒作為中國(guó)的國(guó)酒，有數(shù)千年的歷史，很多重要的場(chǎng)合都離不開(kāi)白酒的身影，白酒已成為我國(guó)文化的一部分[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的科研工作者投入到白酒中健康因子的研究中來(lái)。茅臺(tái)、瀘州老窖等白酒企業(yè)對(duì)白酒與人體健康的關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)茅臺(tái)酒有多種保健功效[2]。李大和等[3]報(bào)道了白酒中的一些微量活性成分對(duì)人體健康的影響。張金修等[4]報(bào)道4-乙基愈創(chuàng)木酚是優(yōu)良的自由基清除劑，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和預(yù)防心血管等多種疾病的發(fā)生，具有預(yù)防疾病、抗衰老、促進(jìn)人體健康的作用。

目前，產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)主要是一些芽孢桿菌和圓酵母[5]。王霜等[6]報(bào)道從濃醬兼香型酒醅中篩選出2株高產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的菌株，分別是地衣芽孢桿菌LS9和枯草芽孢桿菌S10。王少磊等[7]報(bào)道從濃香型大曲中篩選到1株高產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的菌株，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌EG06。

本試驗(yàn)旨在從窖泥中篩選出幾株高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的功能菌，為細(xì)菌麩曲制作提供菌株，以期為白酒生產(chǎn)實(shí)踐提供參考，提高白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：黃鶴樓酒濃香型窖泥。

菌種分離培養(yǎng)基[8]：肉湯固體培養(yǎng)基：牛肉膏質(zhì)量濃度為3 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L、氯化鈉質(zhì)量濃度為5 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度為20 g/L，pH自然，121 ℃下滅菌20 min。

耐受性篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：肉湯液體培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：肉湯液體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮培養(yǎng)基)[7]：麩皮5 g，加水95 mL，混勻后分裝于250 mL三角瓶121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5977B—7890B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS),美國(guó)安捷倫公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-7B電泳儀，北京六一儀器廠；Millipore純水儀等。

1.3 方法

1.3.1 菌種的初步分離純化[8]

無(wú)菌條件下，取5 g窖泥于95 mL 0.9%無(wú)菌生理鹽水中，稀釋度為10-2，搖床中振蕩30 min，然后用移液槍取1 mL稀釋度為10-2的稀釋液于9 mL 0.9%無(wú)菌生理鹽水中，稀釋度為10-3，依次類推，直至10-6，然后用移液槍吸取200 μL稀釋液于肉湯固體培養(yǎng)基平板上涂布均勻，取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度進(jìn)行涂布，每個(gè)稀釋度涂2塊平板，于37 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征并進(jìn)行編號(hào)。

無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取稀釋涂布生長(zhǎng)后的各菌，于肉湯固體培養(yǎng)基平板上劃線，于37 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)24～36 h。

鏡檢：取平板劃線長(zhǎng)好的各編號(hào)單菌落進(jìn)行鏡檢觀察，確定細(xì)菌和酵母菌，對(duì)細(xì)菌采用革蘭氏染色。

1.3.2 高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)功能菌的篩選[10-12]

試驗(yàn)組：將初步分離得到的各菌種按5%的接種量(v/m)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)6 d?？瞻捉M：麩皮5 g，加水95 mL，混勻后分裝于250 mL三角瓶，不接入菌種，于37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。

樣品處理：取100 mL麩皮發(fā)酵液于500 mL蒸餾燒瓶中，加100 mL 50%vol乙醇混勻后真空旋轉(zhuǎn)濃縮，收集餾出液100 mL。

愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的定量檢測(cè)：用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)，采用外標(biāo)法定量。愈創(chuàng)木酚類標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚標(biāo)品分別用無(wú)水乙醇配制10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液(母液)，取適量體積質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚混合制備系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚的質(zhì)量濃度均為100.0～5 000.0 μg/L(即5 000.0、3 000.0、2 500.0、1 000.0、500.0、250.0、100.0 μg/L)，將標(biāo)準(zhǔn)工作液儲(chǔ)存于-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

樣品處理采用頂空固相微萃取法，氣相色譜儀條件為：色譜柱型號(hào)DB-WAX，進(jìn)樣口溫度260 ℃，采用不分流模式進(jìn)樣，初始柱溫50 ℃，保持0 min；以20 ℃/min速度升溫至150 ℃，保持0 min；以10 ℃/min速度升溫至220 ℃，保持5 min；總分析時(shí)間為17 min。載氣為氦氣，恒定流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI；掃描類型SIM掃描；電離能量：70 eV；離子源溫度230 ℃；MS四級(jí)桿溫度150 ℃；閾值100；掃描/s為2.67；掃描質(zhì)量數(shù)50～500 amu。

根據(jù)7個(gè)不同濃度愈創(chuàng)木酚類標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的氣相色譜圖，找到相對(duì)應(yīng)色譜峰面積，作出色譜峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。已知被測(cè)樣品氣相色譜圖中愈創(chuàng)木酚類色譜峰面積，根據(jù)對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算出處理后的樣品中愈創(chuàng)木酚類的濃度。

1.3.3 菌種的分子生物學(xué)鑒定[13]

對(duì)高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的菌株進(jìn)行鑒定。

菌體制備和裂解：在酒精燈火焰旁取培養(yǎng)基上的菌株于研缽，液氮研磨；將研磨好的菌至1.5 mL離心管中，標(biāo)記菌名稱，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，用槍頭吸打均勻，使菌體充分懸?。患尤?50 μL 10% SDS，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻；加入3 μL蛋白酶K(20 ng/μL)，輕輕混勻，37 ℃水浴1 h；

DNA抽提：加入150 μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻；加入150 μL 2% CTAB，輕輕混勻，65 ℃水浴20 min；12 000 r/min常溫離心20 min；

DNA沉淀：小心吸取上清至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置30 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min；吸掉上清，在吸水紙上空干液體，加750 μL 70%乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復(fù)顛倒幾次，12 000 r/min，4 ℃離心2 min；每管加入30 μL純化水溶解沉淀(水中加Rnase，終濃度10 ng/μL)，用手輕彈管壁，4 ℃溶解過(guò)夜；DNA電泳檢測(cè)；PCR擴(kuò)增。

16 s 引物序列：27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACT。

PCR反應(yīng)體系(30 μL)：H2O 17.8 μL；Buffer 3 μL，d NTP 2 μL，Primer1 3 μL，Primer2 3 μL，DNA模板1 μL，酶0.2 μL。

PCR產(chǎn)物電泳鑒定，上機(jī)測(cè)序，輸出峰圖。

1.3.4 菌種耐受性分析[9]

耐酒精能力測(cè)定：制備初始酒精濃度分別為0、4、8、10、12、14%vol的液體培養(yǎng)基，將平板純化后的各單菌種按2%的接種量接到各培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，然后于600 nm分別測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值。

耐酸性能力測(cè)定：制備初始pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的液體培養(yǎng)基，將平板純化后的各單菌種按2%的接種量接到各培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，然后于600 nm分別測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值。

耐糖性能力測(cè)定：制備初始葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%、30%的液體培養(yǎng)基，將平板純化后的各單菌種按2%的接種量接到各培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，然后于600 nm分別測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的初步分離純化

通過(guò)對(duì)窖泥稀釋涂布、平板劃線純化、鏡檢共初步分離得到3株酵母菌，14株細(xì)菌，細(xì)菌分別編號(hào)為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9、B-10、B-11、B-12、B-13、B-14。14株菌鏡檢圖見(jiàn)圖1，菌落形態(tài)及顯微形態(tài)見(jiàn)表1。

圖1 14株菌鏡檢圖(10×100)
Fig.1 Microscopic examination of 14 strains (10×100)

表1菌落形態(tài)及顯微形態(tài)
Table1Colonymorphologyandmicroscopicmorphology

菌株菌落形態(tài)顯微形態(tài)B-1不透明、表面干燥、邊緣整齊規(guī)則、扁平桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-2半透明、表面光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊規(guī)則、臍狀桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-3淡黃色、不透明、表面光滑濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊規(guī)則、扁平桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-4乳白色、不透明、邊緣不整齊、表面干燥、隆起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-5乳白色、半透明、邊緣不整齊、表面干燥、低凸起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-6透明、邊緣整齊規(guī)則、表面干燥、扁平桿狀,革蘭氏陰性菌B-7半透明、顆粒狀不規(guī)則、表面黏稠濕潤(rùn)、扁平桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陰性菌B-8半透明、邊緣齒狀規(guī)則、表面黏稠濕潤(rùn)、隆起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-9透明、邊緣整齊規(guī)則、表面干燥、草帽狀桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-10半透明、邊緣波浪狀不規(guī)則、表面濕潤(rùn)、扁平桿狀,革蘭氏陽(yáng)性菌B-11透明、邊緣整齊不規(guī)則、表面濕潤(rùn)、隆起桿狀,革蘭氏陽(yáng)性菌B-12圓形、不透明、邊緣整齊、表面干燥、隆起桿狀,芽孢桿菌,革蘭氏陽(yáng)性菌B-13圓形、透明、邊緣整齊、表面濕潤(rùn)、扁平桿狀,革蘭氏陽(yáng)性菌B-14微黃色、邊緣整齊不規(guī)則、表面濕潤(rùn)黏稠、隆起桿狀,革蘭氏陽(yáng)性菌

2.2 高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)功能菌的篩選

對(duì)初步分離得到的14株菌進(jìn)行單菌發(fā)酵。通過(guò)GC-MS分別對(duì)不同濃度混標(biāo)和樣品進(jìn)行測(cè)定，得出3種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)，3種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的SIM參數(shù)見(jiàn)表2，3種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表3，14株菌單菌發(fā)酵樣品中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量見(jiàn)表4，部分菌株單菌發(fā)酵色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖2 三種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)色譜峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
Fig.2 Chromatographic peak area-concentration
standard curve of three guaiacols

表23種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的SIM參數(shù)
Table2SIMparametersofthreeguaiacols

序號(hào)保留時(shí)間名稱定性、定量離子18.420愈創(chuàng)木酚81.0、109.0、124.029.2404-甲基愈創(chuàng)木酚95.0、123.0、138.039.8694-乙基愈創(chuàng)木酚122.0、137.0、152.0

表3 3種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線表Table 3 Standard curve of three guaiacols

表414株菌發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量單位：μg/L

Table 4 Contents of guaiacols in the fermentation brothof 4 strains

注：愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量總量為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。

圖3 B-1單菌發(fā)酵氣相色譜圖
Fig.3 Gas chromatogram of B-1 bran single bacteria
fermentation

圖4 B-3單菌發(fā)酵氣相色譜圖
Fig.4 Gas chromatogram of B-3 bran single fermentation

由表2可以看出，愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚的保留時(shí)間分別為8.420、9.240、9.869，由表3可以看出3種愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，可以用于準(zhǔn)確定量，根據(jù)線性方程可分別計(jì)算出各樣品中對(duì)應(yīng)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量。表4可以看出菌株B-8、B-13未檢出愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)，菌株B-1發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量總量為3 632.33μg/L，菌株B-3發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量總量為14 527.31μg/L，高于另外12株菌發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量總量，同時(shí)空白組未檢出愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)，所以選擇菌株B-1、B-3進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。王少磊等[7]從中高溫大曲中篩選到1株產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚的菌株，經(jīng)鑒定為Bacillusamyloliquefaciens，產(chǎn)量為32.89 μg/g。

2.3 菌種分子生物學(xué)鑒定

提取菌株B-1、B-3基因組DNA，然后以基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增出16S rDNA序列，其瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖見(jiàn)圖5。

圖5 菌種基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.5 Electrophoresis map of strain genomic DNA PCR
products

將菌株B-1的16S rDNA(長(zhǎng)度1 458 bp)序列輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中Nucleotide BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的已知分類菌株序列進(jìn)行比較，菌株B-1與Bacillusamyloliquefaciens(KP686226.1)同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株B-1為Bacillusamyloliquefaciens[14]。

將菌株B-3的16S rDNA(長(zhǎng)度1 416 bp)序列輸入美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中Nucleotide BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的已知分類菌株序列進(jìn)行比較，菌株B-3與Delftiasp.X-a12(JX997845.1)同源性最高為99%，因此可以鑒定菌株B-3為Delftiasp.X-a12[15]。

2.4 菌種耐受性分析

2.4.1 耐酒精能力測(cè)定

菌株B-1、B-3耐酒精能力測(cè)定見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 B-1耐酒精能力測(cè)定
Fig.6 B-1 determination of alcohol resistance

圖7 B-3耐酒精能力測(cè)定
Fig.7 B-3 determination of alcohol resistance

通過(guò)對(duì)篩選到的高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株B-1、B-3進(jìn)行耐酒精能力測(cè)定，由圖6、圖7可以看出，隨著酒精濃度的增加，OD值均呈不斷下降趨勢(shì)，當(dāng)酒精度達(dá)8%vol時(shí)，基本上不能生長(zhǎng)，OD值接近0，此時(shí)菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制，當(dāng)酒精度為4%vol時(shí)，菌株B-1 OD值為0.462，菌株B-3 OD值為1.659，說(shuō)明菌株B-1、B-3耐4%vol酒精度能力較強(qiáng),但B-3比B-1更耐4%vol酒精度。

2.4.2 耐酸能力測(cè)定

菌株B-1、B-3耐酸能力測(cè)定圖見(jiàn)圖8、圖9。

圖8 B-1耐酸能力側(cè)定
Fig.8 B-1 acid resistance ability side

圖9 B-3耐酸能力測(cè)定
Fig.9 B-3 acid resistance test

通過(guò)對(duì)篩選到的高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株B-1、B-3進(jìn)行耐酸能力測(cè)定，由圖8、圖9可以看出，隨著pH值的不斷增加，OD值均呈不斷上升趨勢(shì)，當(dāng)pH值小于4時(shí)，菌株生長(zhǎng)均收到明顯的抑制，OD值接近于0。當(dāng)pH為4.5時(shí)，基本上均能正常生長(zhǎng)，B-1 OD值為1.345，B-3 OD值為1.815，說(shuō)明B-3耐酸能力相對(duì)較強(qiáng)。

2.4.3 耐糖能力測(cè)定

菌株B-1、B-3耐糖能力測(cè)定見(jiàn)圖10、圖11。

圖10 B-1耐糖能力測(cè)定
Fig.10 B-1 sugar tolerance test

圖11 B-3耐糖能力測(cè)定
Fig.11 B-3 sugar tolerance test

通過(guò)對(duì)篩選到的高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株B-1、B-3進(jìn)行耐糖能力測(cè)定，由圖10、圖11可以看出，隨著糖度的不斷增加，菌株B-3 OD值呈先上升后下降趨勢(shì)，B-1 OD值呈不斷下降趨勢(shì)。原因可能為隨著糖度的增加，B-3利用糖的能力較強(qiáng)，在糖度為15%時(shí)為菌株提供了充足的碳源，菌株可以良好的生長(zhǎng)，當(dāng)糖度達(dá)20%時(shí)由于受高滲透壓的影響菌株生長(zhǎng)受到抑制，超過(guò)了菌株所需要碳源的量，所以又呈下降趨勢(shì)。而B(niǎo)-1在糖度15%以下時(shí)利用碳源的能力相對(duì)較弱，受高糖滲透壓的影響較大，當(dāng)糖度為20%時(shí)，OD值基本接近于0。

3 結(jié)論

白酒作為我國(guó)的國(guó)酒，歷史悠久，源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，不僅因?yàn)槟芷鸬街d的作用，更重要的是具有重要的保健功效。愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)作為白酒中重要的健康因子之一，近年來(lái)越來(lái)越受到科研工作者的關(guān)注。本試驗(yàn)以窖泥為樣品，通過(guò)稀釋涂布、平板劃線純化、鏡檢、單菌發(fā)酵篩選出高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的功能菌株，然后進(jìn)行菌種鑒定，最后進(jìn)行菌種的耐受性分析，最終篩選出2株高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的功能菌B-1、B-3，分別為Bacillusamyloliquefaciens、Delftiasp.X-a12，總產(chǎn)量分別為3632.33和14527.31μg/L，耐受性分析結(jié)果為菌株B-1、B-3均耐4%vol酒精度、pH 4.5、15%糖度，為細(xì)菌麩曲制作提供菌株和條件，以期為白酒生產(chǎn)實(shí)踐提供參考，提高白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量，提高黃鶴樓濃香型白酒的營(yíng)養(yǎng)健康保健的功效。蔡瑞[11]報(bào)道愈創(chuàng)木酚含量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生一種類似于苯酚類化合物的“藥味”和“消毒水味”，給酒的香氣帶來(lái)不愉快的氣味，所以白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含

量應(yīng)恰到好處，不應(yīng)要求越高越好，含量過(guò)高反而會(huì)破壞酒的風(fēng)味上的平衡協(xié)調(diào)，產(chǎn)生欠缺，需要考慮的是如何使其在白酒中保持一個(gè)適當(dāng)?shù)暮?，這也是以后研究的重點(diǎn)。