甲硝唑陰道凝膠安全性試驗(yàn)研究

龔 云，張英帥*，凌勇根，劉逆夫，蔣飛榮，趙 丞

(1. 株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412007；2. 湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，長(zhǎng)沙 410331)

甲硝唑是細(xì)菌性陰道病的常用藥物，臨床接受程度很高；《2010年美國(guó)疾病控制中心陰道炎治療指南》和中華醫(yī)學(xué)會(huì)擬定的《細(xì)菌性陰道病診治指南(草案)》首選方案均為甲硝唑；但口服或注射制劑副作用大[1-2]，容易產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、過(guò)敏性休克和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]，患者耐受性差[4]。但甲硝唑制成外用的陰道凝膠制劑則可極大的降低副作用，明顯提高患者耐受性[5-7]。本項(xiàng)研究旨在考察甲硝唑陰道凝膠的外用安全性，通過(guò)甲硝唑陰道凝膠對(duì)實(shí)驗(yàn)兔陰道給藥刺激性試驗(yàn)和對(duì)豚鼠皮膚的過(guò)敏性試驗(yàn)[8-10]，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)白色豚鼠，18只，體重320～340 g，雌雄各半。[SCXK(湘)2015-0004], [SYXK(湘)2010-0008],合格證編號(hào)：No.43608300000083。雌雄分籠,飼養(yǎng)于普通環(huán)境內(nèi)，室溫：19.4℃～26.0℃，濕度：49.5%～70.6%。

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔，12只，體重220～250 g，雌性。[SCXK(湘)2015-0004], [SYXK(湘)2015-0016],合格證編號(hào)：No.43608300000101。飼養(yǎng)于普通環(huán)境內(nèi)，室溫：21.9℃～26.1℃，濕度：52.6%～67.7%。

實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-2015(1)062。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

苦味酸(分析純，臺(tái)山市化工廠有限公司，批號(hào)：201201)；無(wú)水乙醇(分析醇，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120621)。2，4-二硝基氯苯(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20121201)，致敏濃度1%，激發(fā)濃度0.1%。甲硝唑陰道凝膠(規(guī)格：0.75%，每支5 g；)，成品批號(hào)：20150407；甲硝唑陰道凝膠空白樣品，批號(hào)：20150630；由株洲千金藥業(yè)股份有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

(一)實(shí)驗(yàn)分組

選取檢疫合格實(shí)驗(yàn)兔18只，每組6只動(dòng)物，雌雄各半。根據(jù)性別體重采用區(qū)段隨機(jī)方法分為3組，分組后進(jìn)行二次編號(hào)，編號(hào)規(guī)則為“組別編號(hào)+性別+個(gè)體編號(hào)”。如1F01，為第一組雌性動(dòng)物的第1號(hào)。各組分別為①基質(zhì)組(甲硝唑陰道凝膠空白樣品)，動(dòng)物正式編號(hào)為1F01～1F03、1M04～1M06，籠卡標(biāo)識(shí)為白色；②陽(yáng)性對(duì)照組(2,4-二硝基氯苯)，動(dòng)物正式編號(hào)為2F01～2F03、2M04～2M06，籠卡標(biāo)識(shí)為藍(lán)色；③甲硝唑陰道凝膠組，動(dòng)物正式編號(hào)為3F01～3F03、3M04～3M06，籠卡標(biāo)識(shí)為紅色。采用5%苦味酸溶液標(biāo)識(shí)動(dòng)物。將豚鼠背部?jī)蓚?cè)用剃毛法進(jìn)行脫毛處理。脫毛區(qū)不少于3×3 cm2。

(二)給藥方法

①致敏接觸 在第0、第7天和第14天，將甲硝唑陰道凝膠空白樣品、1% 2，4-二硝基氯苯和甲硝唑陰道凝膠分別涂在相應(yīng)的動(dòng)物左側(cè)背部脫毛區(qū)，二層紗布(約2.5×2.5 cm2)和一層玻璃紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，6 h后用溫水去掉藥物。

② 激發(fā)接觸 末次給受試物致敏后14 d，在激發(fā)接觸階段，將甲硝唑陰道凝膠空白樣品、0.1% 2，4-二硝基氯苯和甲硝唑陰道凝膠涂于相應(yīng)的動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū)，二層紗布(約2.5×2.5 cm2)和一層玻璃紙覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。6 h后用溫水去掉藥物，即可比較觀察皮膚過(guò)敏反應(yīng)情況，然后于24、48、72 h再次觀察。

(三)觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法

試驗(yàn)期間，每日觀察每只動(dòng)物的癥狀。按表1記錄各組各時(shí)間的平均分值，同時(shí)應(yīng)密切觀察動(dòng)物是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴(yán)重的全身性過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)。根據(jù)試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物皮膚反應(yīng)的差別，判斷受試物對(duì)皮膚過(guò)敏反應(yīng)的性質(zhì)，并根據(jù)表2計(jì)算致敏發(fā)生率：

致敏發(fā)生率(%)=

表1 皮膚過(guò)敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard for the degree of skin allergic reaction

表2 皮膚致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Skin sensitization evaluation criteria

(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.2 兔陰道給藥刺激性實(shí)驗(yàn)

(一)實(shí)驗(yàn)分組

選取檢疫合格12只雌性實(shí)驗(yàn)兔，根據(jù)體重采用完全隨機(jī)方法分為兩組，每組6只。分組后進(jìn)行二次編號(hào)，編號(hào)規(guī)則為“組別編號(hào)+性別+個(gè)體編號(hào)”。如1F01，為第一組雌性動(dòng)物的第1號(hào)。各組分別為①基質(zhì)組(甲硝唑陰道凝膠空白樣品)，動(dòng)物正式編號(hào)為1F01～1F06，籠卡標(biāo)識(shí)為白色；②供試品組(甲硝唑陰道凝膠)，動(dòng)物正式編號(hào)為2F01～2F06，籠卡標(biāo)識(shí)為紅色。

(二)給藥方法

本試驗(yàn)給藥方式為實(shí)驗(yàn)兔陰道給藥。每只實(shí)驗(yàn)兔于固定器上束縛固定其后肢，提起動(dòng)物尾巴暴露出陰道口，給藥量為每只0.5 g凝膠，連續(xù)給藥7 d。①基質(zhì)組放入甲硝唑陰道凝膠空白樣品作為對(duì)照；②供試品組放入0.5 g甲硝唑陰道凝膠(供試品)；初次接觸后24 h和每次試驗(yàn)操作前記錄陰道口和會(huì)陰溢液、紅斑和水腫狀況。末次給予24 h后取6只實(shí)驗(yàn)兔(動(dòng)物編號(hào)為：1F01～1F03和2F01～2F03)實(shí)施CO2麻醉安樂(lè)死，將供試品和基質(zhì)組的進(jìn)行比較然后完整切開(kāi)陰道后縱向剖開(kāi)，檢查上皮組織層的刺激、損傷以及壞死情況，將取下的陰道組織放入固定劑中固定后進(jìn)行組織學(xué)檢查評(píng)價(jià)。另6只實(shí)驗(yàn)兔(動(dòng)物編號(hào)為：1F04～1F06和2F04～2F06)繼續(xù)觀察7 d(若存在持久性損傷，延遲觀察期限以評(píng)價(jià)上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間)，同法肉眼觀察記錄陰道口和會(huì)陰溢液、紅斑和水腫狀況并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以了解刺激性反應(yīng)的可逆程度。

(三)觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法

肉眼觀察評(píng)價(jià)：肉眼觀察實(shí)驗(yàn)兔的陰道組織與對(duì)照兔陰道組織進(jìn)行比較后記錄。

組織學(xué)評(píng)價(jià)：按表3和表4規(guī)定的分類系統(tǒng)對(duì)陰道組織進(jìn)行評(píng)分。給藥組動(dòng)物顯微鏡評(píng)價(jià)記分相加后再除以觀察總數(shù)即得出給藥組的平均記分，最大記分為16。對(duì)照組同法計(jì)算。對(duì)照組動(dòng)物中出現(xiàn)顯微鏡評(píng)價(jià)總分大于9時(shí)，表明試驗(yàn)操作中可能造成損傷。給藥組平均記分減去對(duì)照組平均記分即得出刺激指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)豚鼠皮膚刺激性試驗(yàn)，各組動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡、休克等嚴(yán)重全身性過(guò)敏反應(yīng)。具體結(jié)果見(jiàn)表5和表6。結(jié)果表明：在本試驗(yàn)條件下，甲硝唑陰道凝膠對(duì)豚鼠未見(jiàn)明顯主動(dòng)皮膚過(guò)敏反。

2.2 陰道刺激性試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)兔陰道刺激性試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：末次給藥24 h后解剖的實(shí)驗(yàn)兔供試品組刺激指數(shù)為0，無(wú)刺激反應(yīng)；繼續(xù)觀察7 d后解剖的實(shí)驗(yàn)兔供試品組刺激指數(shù)為0，無(wú)刺激反應(yīng)；在本試驗(yàn)條件下，甲硝唑陰道凝膠，每天1次，共給藥7次，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的陰道組織無(wú)明顯刺激反應(yīng)。具體觀察記錄見(jiàn)表7。

3 討論

本試驗(yàn)旨在探討甲硝唑陰道凝膠外用給藥的安全性，為該藥的臨床應(yīng)用及市場(chǎng)推廣提供試驗(yàn)依據(jù)。

本試驗(yàn)按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(2003)和《藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014)的規(guī)定進(jìn)行。通過(guò)甲硝唑陰道凝膠對(duì)實(shí)驗(yàn)兔陰道給藥刺激性試驗(yàn)。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：基質(zhì)組、供試品組末次給藥24 h后顯微鏡下觀察解剖的實(shí)驗(yàn)兔均陰道黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，完好無(wú)損，未見(jiàn)變性、壞死，固有層結(jié)締組織內(nèi)未見(jiàn)血管充血，水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。繼續(xù)觀察7 d后顯微鏡下觀察僅基質(zhì)組1F04號(hào)實(shí)驗(yàn)兔靠近宮頸處陰道黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其他實(shí)驗(yàn)兔陰道黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，完好無(wú)損，未見(jiàn)變性、壞死，固有層結(jié)締組織內(nèi)未見(jiàn)血管充血，水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。結(jié)果表明甲硝唑陰道凝膠外用給藥未引起陰道刺激性反應(yīng)。通過(guò)采用甲硝唑陰道凝膠對(duì)豚鼠皮膚的過(guò)敏性試驗(yàn)，結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下，甲硝唑陰道凝膠對(duì)豚鼠未見(jiàn)明顯主動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明甲硝唑陰道凝膠用于治療細(xì)菌性陰道炎是較安全的。

表3 陰道組織反應(yīng)顯微鏡分類系統(tǒng)Table 3 Microscopic classification system for the vaginal tissue reaction

表4 刺激指數(shù)Table 4 Indexes of irritation

注：組織的其他異常情況也應(yīng)予以記錄并包括在反應(yīng)的評(píng)價(jià)中。

Note. Other abnormalities of the tissues should also be recorded and included in the evaluation of the response.

凝膠劑是近年來(lái)研究的較多的新劑型[11-15]，具有涂展性好、透皮吸收性好、避免肝臟首過(guò)效應(yīng)、減少胃腸道酶解破壞、局部起效直達(dá)病灶療效好等優(yōu)點(diǎn)，避免了口服和注射劑產(chǎn)生的多種副作用，用藥安全性獲得極大的提高。

甲硝唑用于治療細(xì)菌性陰道炎療效顯著[16-17]，但常規(guī)給藥容易產(chǎn)生的副作用，副作用以胃腸道反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)和神經(jīng)系反應(yīng)為主[1-3]。其中胃腸道反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)主要由甲硝唑藥物本身引起，且胃腸道反應(yīng)與藥物劑量相關(guān)，劑量增加反應(yīng)越明顯[18-19]。而過(guò)敏反應(yīng)多發(fā)生在使用甲硝唑注射劑的患者，有可能是甲硝唑藥物本身引發(fā)，也可能是雜質(zhì)或輔料等其他成分引起，引發(fā)機(jī)理尚不明確[20]。甲硝唑副作用一直困擾醫(yī)生和患者。而將甲硝唑制備成凝膠劑以后很好的解決了此項(xiàng)難題。甲硝唑陰道凝膠可使藥物主要在用藥的局部作用。藥物動(dòng)力學(xué)研究顯示采用陰道凝膠制劑的患者甲硝唑血清濃度僅為口服制劑的2%[7]。筆者通過(guò)小豬的離體皮膚透過(guò)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示：12 h透過(guò)量約為給藥量的27%，皮內(nèi)殘留約為給藥量的1.3%，具體試驗(yàn)內(nèi)容將在后續(xù)研究中報(bào)道。以上研究表明：采用甲硝唑陰道凝膠的患者血藥濃度遠(yuǎn)小于采用甲硝唑口服制劑的患者，因而極大的降低了副作用小，提高了患者用藥的耐受性和安全性。

表5 甲硝唑陰道凝膠給予豚鼠主動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)觀察癥狀評(píng)分情況表(6 h，24 h，n=6)Table 5 Score table of skin allergy test results for guinea pig skin administered metronidazole vaginal gel(6 h,24 h)

表6 甲硝唑陰道凝膠給予豚鼠主動(dòng)皮膚過(guò)敏試驗(yàn)觀察癥狀評(píng)分情況表(48 h，72 h，n=6)Table 6 Score table of skin allergy test results for guinea pig skin administered metronidazole vaginal gel(48 h,72 h)

表7 實(shí)驗(yàn)兔解剖現(xiàn)場(chǎng)凃敷局部肉眼觀察及病理組織學(xué)檢查記錄表Table 7 Checklist of histopathology and visual observation for field coating of experimental rabbit anatomy