諾如病毒感染樹鼩小動(dòng)物模型的初步探索與思考

郭倫愛, 戴迎春, 陳俊銳, 段文韜, 張緒富*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)系，廣州 510515)

人諾如病毒(human noroviruses,HuNoVs)是全球范圍內(nèi)引起成人和兒童非細(xì)菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要病原體，其中60%～90%的HuNoVs急性胃腸炎由GII.4型HuNoVs導(dǎo)致[1]。HuNoVs可在所有年齡段、不同的半密閉場(chǎng)所(幼兒園、學(xué)校、餐館醫(yī)院等)引起暴發(fā)。據(jù)美國(guó)疾病控制中心統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年至少有2300萬HuNoVs導(dǎo)致的病毒性胃腸炎病例，其中800例死亡，發(fā)展中國(guó)家每年因HuNoVs感染而死亡的5歲以下兒童高達(dá)21.8萬[2-3]。由于至今尚未建立有效的HuNoVs體外培養(yǎng)系統(tǒng)和小動(dòng)物感染模型，抗HuNoVs藥物和疫苗研究進(jìn)展緩慢[4]。

樹鼩(Tupaiabelangeri，tree shrew)作為靈長(zhǎng)類動(dòng)物的近親，在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育、病毒感染特性及心理應(yīng)激模式等方面與靈長(zhǎng)類甚至人類之間存在高度的相似性，諸多報(bào)道顯示樹鼩能感染人類甲肝、乙肝、丙肝、輪狀、柯薩奇和皰疹等病毒[5-6]，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。樹鼩能否感染HuNoVs尚未見報(bào)道，本研究首次探索樹鼩作為HuNoVs感染小動(dòng)物模型的可行性并分析討論了該領(lǐng)域存在的困難和未來的研究方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用滇西亞種普通級(jí)雄性樹鼩由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供[SCXK(滇)K2017-0003]，6月齡，體重約120～150 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類研究中心進(jìn)行[SYXK(滇)K2017-0008]，動(dòng)物單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠中，室溫維持在25℃～27℃，人工光照12 h/d，喂以蘋果、面包蟲、雞蛋和混合飼料，籠舍定期清潔消毒，實(shí)驗(yàn)過程符合倫理委員會(huì)要求[IACUC編號(hào)：17006]，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 HuNoVs糞便懸液及正常人群唾液樣本

實(shí)驗(yàn)所用HuNoVs糞便懸液來自于醫(yī)院臨床患者，由本課題組采集保存，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)和基因序列分析鑒定為HuNoVs GII.4型2010和Sydney株[7]。正常人群唾液樣本采集自南方醫(yī)院兒科臨床患者[8]。

1.2 主要試劑與儀器

QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒(52904)，one-step RT-PCR試劑盒(210210)購自QIAGEN 公司，純化豚鼠抗NoV多抗血清由美國(guó)辛辛那提兒科研究中心Jiang Xi教授提供，Blood Group A Antigen(sc-59459)，Blood Group B Antigen(sc-52371)，Blood Group H Antigen(sc-52329)，Lewis a(sc51512)、Lewis b(sc51513)、Lewis x(sc59471)、Lewis y(cas82993)血型抗原購自德國(guó)Santa Cruz公司， HRP-羊抗鼠IgG(A21020)購買于AbbKine公司。免疫組化試劑盒(SA1020), HRP-羊抗鼠IgM(BA1075)購自武漢博士德生物科技公司，碳酸氫鈉(CC0121)購自北京鼎國(guó)生物公司,GeneRuler 1 kb DNA Ladder(SM0312)購買于賽默飛公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HuNoVs灌胃攻毒及樣品采集

15只樹鼩被隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組5只。HuNoVs糞便懸液灌胃前采集唾液50 μL于清潔試管內(nèi)用于人類組織血型抗原(histoblood group antigen，HBGAs)檢測(cè)。HuNoVs攻毒試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[9-10]：樹鼩適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，第4天先進(jìn)行中和胃酸處理，即每只灌服500 μL 100 mmol/L NaHCO3溶液，根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行灌胃攻毒。A、B兩組分別灌服GII-4 2010株和Sydney株糞便懸液(200 μL糞便懸液用800 μL PBS稀釋，約2×105viral RNA copies)，C組(對(duì)照組)灌服1000 μL PBS。攻毒后每天觀察樹鼩飲食、活動(dòng)、毛發(fā)、精神狀態(tài)和糞便性狀，每天早晨收集糞便樣本約1 mL用于病毒檢測(cè)，并參照下表進(jìn)行腹瀉評(píng)分。

表1 腹瀉評(píng)分表Table 1 Diarrhea score

1.3.2 糞便樣本中HuNoVs RNA檢測(cè)

參照本室建立的穩(wěn)定檢測(cè)方法[12]，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取糞便標(biāo)本RNA，以提取所得的RNA 為模板，使用one-step RT-PCR試劑盒，按照說明書進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。分別設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

1.3.3 小腸組織病理標(biāo)本制作觀察以及免疫組化法檢測(cè)HuNoVs抗原

攻毒后第7天處死樹鼩，剪取回腸1 cm，10%甲醛固定2 h進(jìn)行石蠟包埋。蠟塊修整后經(jīng)切片機(jī)切成5 μm薄片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小腸組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及絨毛上皮損傷等情況并拍照。石蠟切片常規(guī)脫蠟和抗原修復(fù)處理后，5% BSA 37℃封閉20 min，1∶250豚鼠抗NoV多抗血清4℃過夜，HRP-羊豚鼠IgG二抗37℃ 20 min，滴加SABC后DAB顯色，脫水、透明、中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.3.4 唾液HBGAs表型鑒定[8]

樹鼩唾液100℃煮沸10 min后用PBS1∶10稀釋，包被于96孔酶聯(lián)板，5%脫脂奶-PBS封閉，分別加入單抗A、B、H、Lewis a、 Lewis b、Lewis x、Lewis y(1∶300稀釋)4℃過夜，加入二抗HRP-羊抗鼠IgG或IgM(1∶3000)后，TMB底物顯色，磷酸溶液終止后酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩攻毒后的癥狀觀察和腹瀉情況

HuNoVs灌胃攻毒樹鼩后，GII-4 2010株組(A組)和Sydney株組(B組)未觀察到精神萎靡、體毛蓬松、飲食減少等感染癥狀，與對(duì)照組相比無差異。三組所有樹鼩均無明顯腹瀉情況發(fā)生，糞便呈粘稠均勻或半液狀均勻狀態(tài)。

2.2 樹鼩糞便HuNoVs RNA檢測(cè)結(jié)果

收集HuNoVs攻毒后連續(xù)7 d的樹鼩糞便樣本，RT-PCR法檢測(cè)HuNoVs，結(jié)果顯示三組105份糞便標(biāo)本均為陰性，圖1為部分代表性樣品RDRP區(qū)域基因的RT-PCR結(jié)果，其中陽性對(duì)照組條帶大小符合預(yù)期(387 bp)，其余無條帶。

2.3 小腸組織光鏡觀察和免疫組化結(jié)果

HuNoVs灌胃攻毒7 d后處死樹鼩，取小腸組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示三組小腸組織病理改變均不明顯，小腸絨毛光整、平滑，固有層無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腸腔無滲出物，結(jié)果見圖2。進(jìn)一步利用免疫組化法檢測(cè)小腸組織中HuNoVs抗原，陽性表達(dá)者將在胞膜和胞漿中呈棕黃色，結(jié)果顯示三組在任意位置均未檢測(cè)到病毒抗原的存在，結(jié)果見圖3。

注：M：DNA marker(1 kb)， 1∶2010株， 2：Sydney株， 3：陰性對(duì)照， 4～6：對(duì)照組， 7～9：感染A組， 10～12感染B組。圖1 樹鼩糞便懸液部分樣品RDRP區(qū)域基因的RT-PCR結(jié)果Note. M: DNA marker (1 kb), 1∶2010 strains, 2: Sydney strains, 3: Negative control, 4-6: Control group, 7-9: Infection group A, 10-12: Infection group B.Figure 1 RT-PCR results of the amplification of the RDRP region

2.4 樹鼩唾液HBGAs分型結(jié)果

近年大量分子流行病學(xué)研究以及利用HuNoVs對(duì)志愿者進(jìn)行攻擊的實(shí)驗(yàn)表明，HBGAs是HuNoVs的天然受體或配體，這可能是HuNoVs在人體腸道中受體吸附的一個(gè)重要機(jī)制。為了進(jìn)一步明確樹鼩外周組織中是否表達(dá)HBGAs，對(duì)三組15份樹鼩唾液進(jìn)行了HBGAs測(cè)定，結(jié)果均為陰性，未檢測(cè)到ABH和Lewis抗原，正常人群的6份唾液中均有不同型別的HBGAs表達(dá)，結(jié)果見圖4。

圖3 樹鼩小腸組織免疫組化觀察(HE染色，×100)Figure 3 Examination of small intestine tissues from tree shrews challenged with HuNoVs (HE staining)

注：1～2：對(duì)照組，3～5：感染A組，6～8：感染B組，9～14：正常人群對(duì)照。圖4 樹鼩唾液中HBGAs的檢測(cè)結(jié)果Note. 1-2：Control group，3-5: Infection group A，6-8：Infection group B，9-14：Normal human population control group.Figure 4 Distribution of HBGAs in saliva from tree shrews

3 討論

HuNoVs作為急性病毒性胃腸炎的重要病原體，在全球范圍內(nèi)帶來了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)公共衛(wèi)生問題[13]。有效的動(dòng)物模型是HuNoVs疫苗和抗病毒藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)和保障，也是研究病毒感染進(jìn)程和致病機(jī)理的主要手段。長(zhǎng)期以來，HuNoVs小動(dòng)物感染模型研究仍是HuNoVs領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

近年來，研究證實(shí)悉生豬是目前最有前景的HuNoVs動(dòng)物感染模型[9-10]。悉生豬在胃腸解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、生理學(xué)、免疫系統(tǒng)等方面與人具有相似的特征，在粘膜表面也存在HBGAs，將其感染人HuNoVs后能導(dǎo)致腹瀉、病毒血癥，并出現(xiàn)糞便排毒和血清轉(zhuǎn)換，另外，悉生牛動(dòng)物模型中也證實(shí)類似結(jié)果[14]。然而，這些悉生大動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖難度大、操作繁瑣、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)限制了其廣泛推廣運(yùn)用[15]。樹鼩是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物，具有個(gè)體小、成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)，蛋白質(zhì)序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)樹鼩與人的蛋白質(zhì)相似度高于嚙齒類動(dòng)物，同時(shí)一些重要神經(jīng)系和免疫系統(tǒng)信號(hào)通路系統(tǒng)與靈長(zhǎng)類動(dòng)物高度相似，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被使用30多年。樹鼩有諸多與人類相似的病毒相關(guān)免疫因子(如淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、PRRs及 MHC等)[16]，許多感染特性與人類相似，多項(xiàng)研究表明樹鼩能感染人類甲肝、乙肝、丙肝、輪狀、皰疹、腺病毒等[17-20]。尤其是樹鼩能感染輪狀病毒的報(bào)道啟示相關(guān)人員[21]：樹鼩能否感染HuNoVs非常值得探索和實(shí)踐。

本研究首次以HuNoVs的優(yōu)勢(shì)流行株GII-4 2010株和Sydney株灌胃攻毒樹鼩，探索了其作為HuNoVs感染模型的可行性。遺憾的是，從樹鼩的腹瀉癥狀、糞便排泄物的病毒檢測(cè)，以及小腸組織的病理學(xué)和病毒抗原等方面都沒有發(fā)現(xiàn)HuNoVs感染的證據(jù)。研究表明10～100個(gè)諾如病毒顆粒即可導(dǎo)致人感染，HuNoVs的悉生豬動(dòng)物模型[9-10]以及應(yīng)用悉生豬動(dòng)物模型進(jìn)行的疫苗評(píng)價(jià)試驗(yàn)[11]研究表明:4～5日齡悉生豬灌胃攻毒量約3×104viral RNA copies，本研究攻毒量為2×105viral RNA copies，相當(dāng)于悉生豬模型中病毒量的5～6倍，所以本研究的攻毒劑量理論上足夠感染樹鼩。結(jié)合近年來HuNoVs感染機(jī)制的最新進(jìn)展，研究人員分析了樹鼩未能感染HuNoVs的可能相關(guān)因素，并思考了今后的研究方向：

一、大量分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)腸道黏膜上的HBGAs是HuNoVs的病毒受體[15]。HBGAs在腸道上皮細(xì)胞上表現(xiàn)為ABH和 Lewis抗原，對(duì)應(yīng)在紅細(xì)胞上表現(xiàn)為分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。目前研究發(fā)現(xiàn)至少共有8 種HuNoVs和組織-血型抗原作用的方式，并可歸為2大類：A/B結(jié)合型(分泌型結(jié)合型)和Lewis結(jié)合型(非分泌型結(jié)合型)[22-23]。樹鼩唾液中未檢測(cè)到HBGAs血型物質(zhì)可能與樹鼩對(duì)HuNoVs不易感有關(guān)。今后建立遺傳背景清晰、HBGAs遺傳成分穩(wěn)定的種群或品系可能是HuNoVs感染樹鼩小動(dòng)物模型的重要方向。

二、悉生豬(和牛)的HuNoVs動(dòng)物感染模型[9-10, 14]的成功提示動(dòng)物腸道的無菌環(huán)境可能也是一個(gè)重要因素。最新的研究表明陰溝腸桿菌能夠抑制HuNoVs感染悉生豬[24]，而且益生菌對(duì)HuNoVs感染具有較好的保護(hù)作用[25]。后續(xù)選用無菌級(jí)的SPF樹鼩(悉生樹鼩或者實(shí)驗(yàn)前后對(duì)樹鼩進(jìn)行抗菌處理)探索HuNoVs感染小動(dòng)物模型的努力仍值得期待。