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    諾如病毒感染樹鼩小動(dòng)物模型的初步探索與思考

    2019-03-01 12:30:40郭倫愛戴迎春陳俊銳段文韜張緒富
    關(guān)鍵詞:動(dòng)物模型唾液灌胃

    郭倫愛, 戴迎春, 陳俊銳, 段文韜, 張緒富*

    (1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)系,廣州 510515)

    人諾如病毒(human noroviruses,HuNoVs)是全球范圍內(nèi)引起成人和兒童非細(xì)菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要病原體,其中60%~90%的HuNoVs急性胃腸炎由GII.4型HuNoVs導(dǎo)致[1]。HuNoVs可在所有年齡段、不同的半密閉場(chǎng)所(幼兒園、學(xué)校、餐館醫(yī)院等)引起暴發(fā)。據(jù)美國(guó)疾病控制中心統(tǒng)計(jì),美國(guó)每年至少有2300萬HuNoVs導(dǎo)致的病毒性胃腸炎病例,其中800例死亡,發(fā)展中國(guó)家每年因HuNoVs感染而死亡的5歲以下兒童高達(dá)21.8萬[2-3]。由于至今尚未建立有效的HuNoVs體外培養(yǎng)系統(tǒng)和小動(dòng)物感染模型,抗HuNoVs藥物和疫苗研究進(jìn)展緩慢[4]。

    樹鼩(Tupaiabelangeri,tree shrew)作為靈長(zhǎng)類動(dòng)物的近親,在生理解剖、神經(jīng)發(fā)育、病毒感染特性及心理應(yīng)激模式等方面與靈長(zhǎng)類甚至人類之間存在高度的相似性,諸多報(bào)道顯示樹鼩能感染人類甲肝、乙肝、丙肝、輪狀、柯薩奇和皰疹等病毒[5-6],目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。樹鼩能否感染HuNoVs尚未見報(bào)道,本研究首次探索樹鼩作為HuNoVs感染小動(dòng)物模型的可行性并分析討論了該領(lǐng)域存在的困難和未來的研究方向。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    實(shí)驗(yàn)用滇西亞種普通級(jí)雄性樹鼩由中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供[SCXK(滇)K2017-0003],6月齡,體重約120~150 g,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院昆明靈長(zhǎng)類研究中心進(jìn)行[SYXK(滇)K2017-0008],動(dòng)物單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠中,室溫維持在25℃~27℃,人工光照12 h/d,喂以蘋果、面包蟲、雞蛋和混合飼料,籠舍定期清潔消毒,實(shí)驗(yàn)過程符合倫理委員會(huì)要求[IACUC編號(hào):17006],并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

    1.1.2 HuNoVs糞便懸液及正常人群唾液樣本

    實(shí)驗(yàn)所用HuNoVs糞便懸液來自于醫(yī)院臨床患者,由本課題組采集保存,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)和基因序列分析鑒定為HuNoVs GII.4型2010和Sydney株[7]。正常人群唾液樣本采集自南方醫(yī)院兒科臨床患者[8]。

    1.2 主要試劑與儀器

    QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒(52904),one-step RT-PCR試劑盒(210210)購自QIAGEN 公司,純化豚鼠抗NoV多抗血清由美國(guó)辛辛那提兒科研究中心Jiang Xi教授提供,Blood Group A Antigen(sc-59459),Blood Group B Antigen(sc-52371),Blood Group H Antigen(sc-52329),Lewis a(sc51512)、Lewis b(sc51513)、Lewis x(sc59471)、Lewis y(cas82993)血型抗原購自德國(guó)Santa Cruz公司, HRP-羊抗鼠IgG(A21020)購買于AbbKine公司。免疫組化試劑盒(SA1020), HRP-羊抗鼠IgM(BA1075)購自武漢博士德生物科技公司,碳酸氫鈉(CC0121)購自北京鼎國(guó)生物公司,GeneRuler 1 kb DNA Ladder(SM0312)購買于賽默飛公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 HuNoVs灌胃攻毒及樣品采集

    15只樹鼩被隨機(jī)分為A、B、C 3組,每組5只。HuNoVs糞便懸液灌胃前采集唾液50 μL于清潔試管內(nèi)用于人類組織血型抗原(histoblood group antigen,HBGAs)檢測(cè)。HuNoVs攻毒試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[9-10]:樹鼩適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,第4天先進(jìn)行中和胃酸處理,即每只灌服500 μL 100 mmol/L NaHCO3溶液,根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行灌胃攻毒。A、B兩組分別灌服GII-4 2010株和Sydney株糞便懸液(200 μL糞便懸液用800 μL PBS稀釋,約2×105viral RNA copies),C組(對(duì)照組)灌服1000 μL PBS。攻毒后每天觀察樹鼩飲食、活動(dòng)、毛發(fā)、精神狀態(tài)和糞便性狀,每天早晨收集糞便樣本約1 mL用于病毒檢測(cè),并參照下表進(jìn)行腹瀉評(píng)分。

    表1 腹瀉評(píng)分表Table 1 Diarrhea score

    1.3.2 糞便樣本中HuNoVs RNA檢測(cè)

    參照本室建立的穩(wěn)定檢測(cè)方法[12],使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取糞便標(biāo)本RNA,以提取所得的RNA 為模板,使用one-step RT-PCR試劑盒,按照說明書進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。分別設(shè)置陽性和陰性對(duì)照,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

    1.3.3 小腸組織病理標(biāo)本制作觀察以及免疫組化法檢測(cè)HuNoVs抗原

    攻毒后第7天處死樹鼩,剪取回腸1 cm,10%甲醛固定2 h進(jìn)行石蠟包埋。蠟塊修整后經(jīng)切片機(jī)切成5 μm薄片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察小腸組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及絨毛上皮損傷等情況并拍照。石蠟切片常規(guī)脫蠟和抗原修復(fù)處理后,5% BSA 37℃封閉20 min,1∶250豚鼠抗NoV多抗血清4℃過夜,HRP-羊豚鼠IgG二抗37℃ 20 min,滴加SABC后DAB顯色,脫水、透明、中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

    1.3.4 唾液HBGAs表型鑒定[8]

    樹鼩唾液100℃煮沸10 min后用PBS1∶10稀釋,包被于96孔酶聯(lián)板,5%脫脂奶-PBS封閉,分別加入單抗A、B、H、Lewis a、 Lewis b、Lewis x、Lewis y(1∶300稀釋)4℃過夜,加入二抗HRP-羊抗鼠IgG或IgM(1∶3000)后,TMB底物顯色,磷酸溶液終止后酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,記錄結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 樹鼩攻毒后的癥狀觀察和腹瀉情況

    HuNoVs灌胃攻毒樹鼩后,GII-4 2010株組(A組)和Sydney株組(B組)未觀察到精神萎靡、體毛蓬松、飲食減少等感染癥狀,與對(duì)照組相比無差異。三組所有樹鼩均無明顯腹瀉情況發(fā)生,糞便呈粘稠均勻或半液狀均勻狀態(tài)。

    2.2 樹鼩糞便HuNoVs RNA檢測(cè)結(jié)果

    收集HuNoVs攻毒后連續(xù)7 d的樹鼩糞便樣本,RT-PCR法檢測(cè)HuNoVs,結(jié)果顯示三組105份糞便標(biāo)本均為陰性,圖1為部分代表性樣品RDRP區(qū)域基因的RT-PCR結(jié)果,其中陽性對(duì)照組條帶大小符合預(yù)期(387 bp),其余無條帶。

    2.3 小腸組織光鏡觀察和免疫組化結(jié)果

    HuNoVs灌胃攻毒7 d后處死樹鼩,取小腸組織進(jìn)行HE染色,結(jié)果顯示三組小腸組織病理改變均不明顯,小腸絨毛光整、平滑,固有層無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腸腔無滲出物,結(jié)果見圖2。進(jìn)一步利用免疫組化法檢測(cè)小腸組織中HuNoVs抗原,陽性表達(dá)者將在胞膜和胞漿中呈棕黃色,結(jié)果顯示三組在任意位置均未檢測(cè)到病毒抗原的存在,結(jié)果見圖3。

    注:M:DNA marker(1 kb), 1∶2010株, 2:Sydney株, 3:陰性對(duì)照, 4~6:對(duì)照組, 7~9:感染A組, 10~12感染B組。圖1 樹鼩糞便懸液部分樣品RDRP區(qū)域基因的RT-PCR結(jié)果Note. M: DNA marker (1 kb), 1∶2010 strains, 2: Sydney strains, 3: Negative control, 4-6: Control group, 7-9: Infection group A, 10-12: Infection group B.Figure 1 RT-PCR results of the amplification of the RDRP region

    2.4 樹鼩唾液HBGAs分型結(jié)果

    近年大量分子流行病學(xué)研究以及利用HuNoVs對(duì)志愿者進(jìn)行攻擊的實(shí)驗(yàn)表明,HBGAs是HuNoVs的天然受體或配體,這可能是HuNoVs在人體腸道中受體吸附的一個(gè)重要機(jī)制。為了進(jìn)一步明確樹鼩外周組織中是否表達(dá)HBGAs,對(duì)三組15份樹鼩唾液進(jìn)行了HBGAs測(cè)定,結(jié)果均為陰性,未檢測(cè)到ABH和Lewis抗原,正常人群的6份唾液中均有不同型別的HBGAs表達(dá),結(jié)果見圖4。

    圖3 樹鼩小腸組織免疫組化觀察(HE染色,×100)Figure 3 Examination of small intestine tissues from tree shrews challenged with HuNoVs (HE staining)

    注:1~2:對(duì)照組,3~5:感染A組,6~8:感染B組,9~14:正常人群對(duì)照。圖4 樹鼩唾液中HBGAs的檢測(cè)結(jié)果Note. 1-2:Control group,3-5: Infection group A,6-8:Infection group B,9-14:Normal human population control group.Figure 4 Distribution of HBGAs in saliva from tree shrews

    3 討論

    HuNoVs作為急性病毒性胃腸炎的重要病原體,在全球范圍內(nèi)帶來了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)公共衛(wèi)生問題[13]。有效的動(dòng)物模型是HuNoVs疫苗和抗病毒藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié)和保障,也是研究病毒感染進(jìn)程和致病機(jī)理的主要手段。長(zhǎng)期以來,HuNoVs小動(dòng)物感染模型研究仍是HuNoVs領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

    近年來,研究證實(shí)悉生豬是目前最有前景的HuNoVs動(dòng)物感染模型[9-10]。悉生豬在胃腸解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、生理學(xué)、免疫系統(tǒng)等方面與人具有相似的特征,在粘膜表面也存在HBGAs,將其感染人HuNoVs后能導(dǎo)致腹瀉、病毒血癥,并出現(xiàn)糞便排毒和血清轉(zhuǎn)換,另外,悉生牛動(dòng)物模型中也證實(shí)類似結(jié)果[14]。然而,這些悉生大動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖難度大、操作繁瑣、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)限制了其廣泛推廣運(yùn)用[15]。樹鼩是一種形似松鼠的小型哺乳動(dòng)物,具有個(gè)體小、成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn),蛋白質(zhì)序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)樹鼩與人的蛋白質(zhì)相似度高于嚙齒類動(dòng)物,同時(shí)一些重要神經(jīng)系和免疫系統(tǒng)信號(hào)通路系統(tǒng)與靈長(zhǎng)類動(dòng)物高度相似,作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被使用30多年。樹鼩有諸多與人類相似的病毒相關(guān)免疫因子(如淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、PRRs及 MHC等)[16],許多感染特性與人類相似,多項(xiàng)研究表明樹鼩能感染人類甲肝、乙肝、丙肝、輪狀、皰疹、腺病毒等[17-20]。尤其是樹鼩能感染輪狀病毒的報(bào)道啟示相關(guān)人員[21]:樹鼩能否感染HuNoVs非常值得探索和實(shí)踐。

    本研究首次以HuNoVs的優(yōu)勢(shì)流行株GII-4 2010株和Sydney株灌胃攻毒樹鼩,探索了其作為HuNoVs感染模型的可行性。遺憾的是,從樹鼩的腹瀉癥狀、糞便排泄物的病毒檢測(cè),以及小腸組織的病理學(xué)和病毒抗原等方面都沒有發(fā)現(xiàn)HuNoVs感染的證據(jù)。研究表明10~100個(gè)諾如病毒顆粒即可導(dǎo)致人感染,HuNoVs的悉生豬動(dòng)物模型[9-10]以及應(yīng)用悉生豬動(dòng)物模型進(jìn)行的疫苗評(píng)價(jià)試驗(yàn)[11]研究表明:4~5日齡悉生豬灌胃攻毒量約3×104viral RNA copies,本研究攻毒量為2×105viral RNA copies,相當(dāng)于悉生豬模型中病毒量的5~6倍,所以本研究的攻毒劑量理論上足夠感染樹鼩。結(jié)合近年來HuNoVs感染機(jī)制的最新進(jìn)展,研究人員分析了樹鼩未能感染HuNoVs的可能相關(guān)因素,并思考了今后的研究方向:

    一、大量分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)腸道黏膜上的HBGAs是HuNoVs的病毒受體[15]。HBGAs在腸道上皮細(xì)胞上表現(xiàn)為ABH和 Lewis抗原,對(duì)應(yīng)在紅細(xì)胞上表現(xiàn)為分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。目前研究發(fā)現(xiàn)至少共有8 種HuNoVs和組織-血型抗原作用的方式,并可歸為2大類:A/B結(jié)合型(分泌型結(jié)合型)和Lewis結(jié)合型(非分泌型結(jié)合型)[22-23]。樹鼩唾液中未檢測(cè)到HBGAs血型物質(zhì)可能與樹鼩對(duì)HuNoVs不易感有關(guān)。今后建立遺傳背景清晰、HBGAs遺傳成分穩(wěn)定的種群或品系可能是HuNoVs感染樹鼩小動(dòng)物模型的重要方向。

    二、悉生豬(和牛)的HuNoVs動(dòng)物感染模型[9-10, 14]的成功提示動(dòng)物腸道的無菌環(huán)境可能也是一個(gè)重要因素。最新的研究表明陰溝腸桿菌能夠抑制HuNoVs感染悉生豬[24],而且益生菌對(duì)HuNoVs感染具有較好的保護(hù)作用[25]。后續(xù)選用無菌級(jí)的SPF樹鼩(悉生樹鼩或者實(shí)驗(yàn)前后對(duì)樹鼩進(jìn)行抗菌處理)探索HuNoVs感染小動(dòng)物模型的努力仍值得期待。

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