功能驗(yàn)證P62基因在胰腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用

田文嘉 林香春

(北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院，北京 102206)

胰腺癌是消化道系統(tǒng)預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)死亡中位列第四〔1〕，而轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主要原因之一〔2〕。胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多信號(hào)通路參與的復(fù)雜的生物過(guò)程〔3〕。因此，發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證與胰腺癌轉(zhuǎn)移有因果關(guān)系的基因及其分子機(jī)制對(duì)胰腺癌的診斷和治療有重要意義。本實(shí)驗(yàn)在結(jié)合前期全基因組基因突變技術(shù)篩選得到的P62基因的基礎(chǔ)上，利用小干擾RNA(siRNA)、Werstern印跡、細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(CCK-8)等方法，進(jìn)一步探討P62基因在胰腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人胰腺癌AsPC-1來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)NQBB公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，抗P62單克隆抗體購(gòu)自Cell Signalling公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10% FBS，將AsPC-1細(xì)胞放于含有5%CO2的37℃恒溫孵箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3總RNA的提取和熒光定量PCR 用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)P62 mRNA的表達(dá)情況。熒光定量PCR引物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成，P62上游引物序列為5′-CUUGCGUAGAAUUGCAGGUTT-3′，下游引物序列為5′-ACCUGCAAUUCUACGCAAGTT-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物序列為5′-TCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游引物序列為5′-CAAATTCGTTGTCATACCAG-3′。熒光定量PCR條件：95℃ 10 min；94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4蛋白質(zhì)印跡法 細(xì)胞用放射免疫沉淀法裂解液(RIPA)裂解提取蛋白質(zhì)后用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用兔抗人P62(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)孵育過(guò)夜。羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育1 h。蛋白質(zhì)表達(dá)水平用電化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒檢測(cè)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照(NC)組和P62 siRNA干擾(si-P62)組，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AsPC-1種植于6孔板中，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)的操作，分別將等量的NC及P62特異性siRNA轉(zhuǎn)染至兩組細(xì)胞中,細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

1.6CCK-8實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AsPC-1細(xì)胞清洗、消化，制備成細(xì)胞懸液，根據(jù)每孔2 000個(gè)細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞懸液接種到96孔板上，每孔200 μl，每個(gè)樣本重復(fù)6次。分別將等量的NC及P62特異性siRNA轉(zhuǎn)染至兩組細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)4 h后，換液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。在每天同一時(shí)間向每孔中加入20 μl CCK-8溶液，在37℃孵箱中孵育3 h，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后的胰腺癌細(xì)胞的增殖情況。用酶標(biāo)儀測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)(12、24、36、48 h)兩組細(xì)胞在450nm波長(zhǎng)處的光吸收值(A值)，以反映細(xì)胞的增殖情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組P62 mRNA表達(dá)情況比較 si-P62組(0.036±0.05)P62 mRNA表達(dá)水平明顯低于NC組(1.000±0.90,P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組P62蛋白表達(dá)結(jié)果

2.2P62表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 與NC組相比，si-P62組細(xì)胞24、36、48 h細(xì)胞A值均顯著下降(P<0.01，P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 兩組12、24、36、48 h細(xì)胞增殖能力比較

3 討 論

近年來(lái)，胰腺癌患者的治療仍然是早期根治性手術(shù)切除加術(shù)后放療、化療，而胰腺癌起病隱匿，早期沒(méi)有特異性的臨床癥狀和體征，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中、晚期階段，超過(guò)80%的患者由于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而沒(méi)有機(jī)會(huì)獲得治愈性的手術(shù)切除〔4〕，所以胰腺癌的死亡率依然沒(méi)有明顯改善。

自噬的概念是由Ashford等〔5〕在1962年研究肝細(xì)胞糖代謝時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象后提出來(lái)的。在正常情況下，自噬能夠通過(guò)對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解，從而實(shí)現(xiàn)自身細(xì)胞器的更新。然而，研究發(fā)現(xiàn)自噬是一把雙刃劍，它在正常細(xì)胞中扮演抑制細(xì)胞癌變的角色，但在已經(jīng)發(fā)生癌變的細(xì)胞中，自噬卻能夠通過(guò)賦予腫瘤細(xì)胞抵抗外界不良環(huán)境的能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔6〕。研究已經(jīng)揭示哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、大鼠肉瘤(RAS)-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路在自噬中起重要的作用〔7〕，但是，對(duì)于自噬在腫瘤細(xì)胞中具體的分子機(jī)制仍不清楚。

本研究選用分化好、惡性程度相對(duì)低的AsPC-1人胰腺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，在前期采用全基因組隨機(jī)基因敲除技術(shù)平臺(tái)，篩選得到的能夠?qū)⒌娃D(zhuǎn)移性AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦咿D(zhuǎn)移細(xì)胞的P62基因的基礎(chǔ)上〔8〕，進(jìn)一步功能驗(yàn)證P62基因在胰腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步探討P62影響胰腺癌轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。