肝細胞癌循環(huán)腫瘤細胞的監(jiān)測及其臨床意義

牛劍祥 宋瑞 王萬祥

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

肝細胞癌(HCC)占全部肝癌的90%以上，是肝癌主要的病理類型〔1〕。HCC細胞惡性程度高，增殖轉(zhuǎn)移能力強，病情進展迅速，總體5年生存率僅5%左右〔2〕。目前手術(shù)切除仍是最主要的治療方法，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為阻礙HCC患者長期生存的關(guān)鍵〔3〕。外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)與多種腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，CTCs數(shù)目可以反映腫瘤負荷，能用于檢測療效，且比標(biāo)準(zhǔn)的影像學(xué)改變更早〔4,5〕。但CTCs對于檢測HCC的發(fā)生、手術(shù)療效的評估及預(yù)測患者生存率的意義尚不明確，本研究應(yīng)用基于生物素化去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的循環(huán)HCC分離/鑒定方法檢測CTCs，評價手術(shù)切除HCC組織對HCC治療及預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科2014年1月至2016年12月行手術(shù)治療的HCC患者60例，男27例，女33例；年齡23～80〔平均(55.7±9.4)〕歲；患者均為初發(fā)且術(shù)前未經(jīng)任何形式的抗腫瘤治療，術(shù)后經(jīng)病理證實為HCC?；颊呒捌浼覍僦橥?。

1.2實驗材料 去唾液酸胎球蛋白、L-賴氨酸購自美國Sigma公司；Sulfo-NHS-1C-Biotin、二喹啉甲酸(BAC)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；抗生物素抗體磁珠、CK-3-6H5單克隆抗體購自德國Miltenyi公司；Ficoll-Paque PLUS 購自天津灝陽；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自博士德公司；二步法免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司；TritonX-100(即用型細胞通透劑)購自Amresco公司；CK-3-6H5購自德國Miltenyi公司；L535R型高速離心機；RT-6100型酶標(biāo)分析儀購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；MS磁性分選柱、MACS磁性分選器購自德國Miltenyi公司。

1.3實驗方法 采用基于ASGPR的循環(huán)HCC細胞分離/鑒定系統(tǒng)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測患者外周靜脈血中CTCs。真空采血針取患者術(shù)前、術(shù)后第1天及第7天肘正中靜脈血7.5 ml，并加入肝素抗凝，1∶1與生理鹽水混合均勻，加至3 ml細胞分離液層上，室溫下2 000 r/min離心20 min，吸取單個核細胞層，5 ml生理鹽水洗滌3次，室溫下2 000 r/min離心10 min。將外周血單個核細胞進行去唾液酸胎球蛋白生物素化標(biāo)記。將二者混合并于37℃恒溫水浴箱孵育45 min磁性標(biāo)記HCC，利用磁分選儀器分離，免疫組織化學(xué)染色鑒定，鏡下觀察：Hep Par 1 陽性，細胞呈橢圓形，棕黃色，細胞核完整，核質(zhì)比高、體積大等特征。排除非特異染色的細胞和細胞碎片，符合上述特征的細胞為CTCs〔6〕。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各時期CTCs陽性率比較 術(shù)后第7天CTCs陽性率〔15例(25.0%)〕顯著低于術(shù)前〔28例(46.7%)〕及術(shù)后第1天〔35例(58.3%)；χ2=6.125，13.714，P=0.013，P<0.001〕。

2.2術(shù)前CTCs陽性率與臨床資料的關(guān)系 術(shù)前CTCs陽性患者腫瘤直徑、數(shù)目及血管浸潤率均顯著高于陰性患者(P<0.05)，而年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)濃度、乙肝表面抗原(HbsAg)水平、腫瘤分化程度、Child分級差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3術(shù)前CTCs陽性率與患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)前CTCs陽性患者預(yù)后總生存時間明顯短于陰性患者(P<0.05)，見圖1。

表1 術(shù)前CTCs陽性率與臨床資料的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 患者術(shù)前CTCs陽性率與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

CTCs多因腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用或診療操作從實體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入循環(huán)系統(tǒng)，是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，研究顯示CTCs是乳腺癌細胞在小鼠模型體內(nèi)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，同時CTCs陽性率高的乳腺癌患者預(yù)后及臨床表現(xiàn)不良〔7〕，且CTCs細胞群相比原發(fā)灶腫瘤細胞具有更強的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及干細胞表型，具有較強的惡性行為及耐藥能力〔8〕。目前許多研究指出，CTCs對腫瘤患者預(yù)后、復(fù)發(fā)風(fēng)險及療效的評估具有潛在的指導(dǎo)價值，包括胰腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌及肝癌〔9～12〕，但CTCs與HCC病理分型進展及預(yù)后的關(guān)系尚無系統(tǒng)性研究。本研究結(jié)果提示CTCs陽性患者病情進展較深，由于未納入遠處轉(zhuǎn)移患者，故無法探究CTCs與患者遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)系，但HCC腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與腫瘤直徑、數(shù)目及血管浸潤均存在密切聯(lián)系，肝癌的增殖分為多中心增殖和單中心增殖，即肝內(nèi)腫瘤的多發(fā)生長及單發(fā)生長，多中心增殖更容易發(fā)生術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或肝內(nèi)的自體轉(zhuǎn)移〔13,14〕。CTCs的遠處轉(zhuǎn)移方式有多種，且肝臟的血供比較豐富，術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，其中以血行轉(zhuǎn)移最為普遍。腫瘤越大、數(shù)目越多、血管浸潤程度越深，發(fā)生CTCs的脫落及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率越高，本研究結(jié)果也從側(cè)面反映了CTCs對于HCC轉(zhuǎn)移的潛在指導(dǎo)作用。預(yù)后分析結(jié)果表明CTCs對HCC患者預(yù)后評估具有良好的應(yīng)用價值。術(shù)后第1天患者CTCs檢出率出現(xiàn)小幅度升高，推測可能是在手術(shù)切除腫瘤組織過程中造成的機械損傷及應(yīng)激等多重作用的影響下，導(dǎo)致HCC組織細胞的脫落進而進入循環(huán)系統(tǒng)，而術(shù)后第7天顯著降低可能是由于機械損傷及應(yīng)激進入循環(huán)的HCC細胞為非自發(fā)進入循環(huán)的腫瘤細胞，與惡性生物學(xué)特性較強的CTCs群體存在本質(zhì)差別，導(dǎo)致其被免疫系統(tǒng)清除，而手術(shù)治療可顯著減輕原發(fā)灶負荷，減少CTCs的來源，提示CTCs可在一定程度上反映HCC治療療效。

本研究表明，通過對外周血中CTCs 的檢測可以早期檢測HCC的發(fā)生、評估HCC手術(shù)治療的療效、監(jiān)測HCC轉(zhuǎn)移及預(yù)測患者生存率，可能成為臨床治療HCC遠出轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要手段。