穿心蓮花粉活力測定及離體萌發(fā)特性研究

石志棉， 姬璇， 杜勤， 梁譽青， 蘇雨苗， 劉瀟晗

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

穿心蓮來源于爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees，別名一見喜、斬蛇草、苦草、橄欖蓮等，為廣東道地藥材，以地上部分入藥[1]。味苦，性寒。具有清熱、解毒、涼血、消腫的功效，用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、口舌生瘡、頓咳勞嗽、泄瀉痢疾、熱淋澀痛、癰腫瘡瘍、蛇蟲咬傷等病癥的治療[2]。主要化學(xué)成分為穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等[3]。穿心蓮由于長期人工栽培，目前品種退化、產(chǎn)量下降、有效成分含量降低等現(xiàn)象嚴(yán)重[4，5]。有性繁殖是常規(guī)育種的主要方式之一，花粉作為雄配子體，它的萌發(fā)及花粉管的伸長直接影響育種成效[6]；而且花粉管便于培養(yǎng)和離體操作，一直是研究細(xì)胞極性生長、細(xì)胞間相互作用以及信號傳導(dǎo)等細(xì)胞學(xué)問題的理想模式系統(tǒng)[7-11]。因此，本研究以穿心蓮花粉為實驗材料，建立穿心蓮花粉體外萌發(fā)適宜培養(yǎng)方法。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1樣品穿心蓮花采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥圃，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室杜勤教授鑒定，為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees。

1.2試劑與儀器碘（I2，廣州化學(xué)試劑廠，批號：20151015）；碘化鉀（KI，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20131021）；紅四氮唑（TTC，上海Macklin公司，批號：C10101070）；蔗糖（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：2015032068）；硼酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：2015604010）；氯化鈣（天津大茂化學(xué)試劑廠，批號：201501016）；聚乙二醇6000（PEG6000，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20171034）；赤霉素（GA3，廣州浩瑪生物科技有限公司，批號：38035359）。YS100光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；SM2 1000體視鏡（日本Nikon公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 I2-KI染色法測定花粉活力 配制I2-KI溶液：稱取2 g KI溶于20 mL蒸餾水中，加1 g I2全溶后，定容至300 mL。染色：剝?nèi)〔煌幗z比的花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，制成花粉涂片，滴1～2滴I2-KI溶液，染色5 min，10倍鏡鏡檢。染成紫色的為有活性的花粉，褐色的沒有活性，統(tǒng)計100粒花粉，重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

1.3.2 TTC染色法測定花粉活力 0.5%TTC溶液的配制：精密稱量0.1 g TTC，定容至20 mL，調(diào)pH至7.7左右，現(xiàn)用現(xiàn)配。染色：剝?nèi)〔煌幗z比的花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，涂抹在凹形載玻片上，在花粉上滴1～2滴0.5%TTC溶液攪拌均勻；將玻片于35℃恒溫箱中放置15 min，避光染色，10倍鏡鏡檢。染成紅色的為有活性的花粉，沒有染色的沒有活性，統(tǒng)計100粒花粉，重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

1.3.3 花粉管離體萌發(fā)法測定花粉活力

1.3.3.1 花粉萌發(fā)培養(yǎng)液優(yōu)化 采用正交設(shè)計法[12]，考察 100、150、200 g/L 蔗糖，0.1、0.3、0.5 g/L 氯化鈣，0.5、1、2 g/L 硼酸，50、100、150 g/L PEG6000質(zhì)量濃度梯度對穿心蓮花粉萌發(fā)的影響。正交試驗設(shè)計因素水平安排表及試驗方案見表1、2。

按表2分別配制100 mL花粉萌發(fā)培養(yǎng)液。將配制好的培養(yǎng)液均勻滴在凹形載玻片中間備用。采集即將開放或已開放（即藥絲比1∶6）的小花，用鑷子擠壓花藥，使花粉均勻撒在培養(yǎng)液上，（25±2）℃配合2000 Lux光照（光照10 h，黑暗14 h）培養(yǎng)24h，在10倍鏡下鏡檢。以花粉管長度超過花粉直徑為萌發(fā)，統(tǒng)計100?；ǚ鄣拿劝l(fā)情況，重復(fù)3次。

表1 花粉管萌發(fā)正交試驗設(shè)計因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal test design for pollen tube germination[ρ/（g·L-1）]

表2 花粉管萌發(fā)正交試驗方案Table 2Orthogonal test scheme for pollen tube germination[ρ/（g·L-1）]

1.3.3.2 GA3質(zhì)量濃度對花粉管萌發(fā)的影響 以上述正交試驗得出的最佳組合為基礎(chǔ)培養(yǎng)液配方，分別加入0.001、0.01、0.1 g/L GA3，考察不同質(zhì)量濃度GA3對花粉管萌發(fā)的影響。

1.3.3.3 預(yù)處理對花粉管萌發(fā)的影響 采用正交試驗設(shè)計統(tǒng)計得出的最佳培養(yǎng)液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取即將盛開或已盛開的小花，分別進(jìn)行4℃冷預(yù)處理24、48 h，30℃熱預(yù)處理24、48 h，不處理。剝?nèi)セㄋ帲眯¤囎虞p輕擠壓花藥，將花藥均勻撒在培養(yǎng)液上，在27℃下培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察花粉管萌發(fā)情況，每個視野統(tǒng)計100?；ǚ?，重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

1.3.3.4 光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)對穿心蓮花粉管萌發(fā)的影響 采用正交試驗設(shè)計統(tǒng)計得出的最佳培養(yǎng)液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取經(jīng)最適預(yù)處理的即將盛開或已盛開的小花，剝?nèi)セㄋ?，用小鑷子輕輕擠壓花藥，將花藥均勻撒在培養(yǎng)液上，在光照及黑暗的條件下培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察花粉管萌發(fā)情況，每個視野統(tǒng)計100?；ǚ郏貜?fù)3次，記錄結(jié)果。

1.3.3.5 花粉管萌發(fā)法測定穿心蓮花粉活性 采用正交試驗設(shè)計統(tǒng)計得出的最佳培養(yǎng)液，均勻滴在凹形載玻片中間。分別在8:00、15:00 2個時間段采集藥絲比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的4種小花，經(jīng)最適預(yù)處理后備用。將完成預(yù)處理的小花，剝?nèi)セㄋ帲眯¤囎虞p輕擠壓花藥，將花藥均勻撒在培養(yǎng)液上，在最適條件下培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，每個視野統(tǒng)計100粒花粉，重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1I2-KI染色法測定穿心蓮花粉活力用I2-KI染色法測定穿心蓮花粉活力，試驗結(jié)果見表3、圖1。

由表3、圖1可知，15:00采集的藥絲比為1∶4的花粉染色率最高，而8:00采集的藥絲比為1∶6的花粉染色率最低，花粉活性隨藥絲比的減小呈先增高后下降的趨勢，相同藥絲比的小花，15:00采集的花粉活性比8:00采集的花粉高。

2.2TTC染色法測定穿心蓮花粉活力用TTC染色法測定穿心蓮花粉活力，試驗結(jié)果見表4、圖2。

由表4、圖2可知，15:00采集的藥絲比為1∶6的花粉染色率最高，而15:00采集的藥絲比為1∶1的花粉染色率最低，花粉活性隨藥絲比的減小呈增高的趨勢，相同藥絲比的小花，15:00采集的花粉活性比8:00采集的花粉高。

2.3花粉管離體萌發(fā)法測定穿心蓮花粉活力

2.3.1 花粉管離體萌發(fā)培養(yǎng)液優(yōu)化 考察100、150、200 g/L蔗糖質(zhì)量濃度梯度，0.1、0.3、0.5 g/L氯化鈣質(zhì)量濃度梯度，0.5、1、2 g/L硼酸質(zhì)量濃度梯度，50、100、150 g/L PEG6000質(zhì)量濃度梯度對穿心蓮花粉萌發(fā)率的影響。試驗結(jié)果及分析見表5。

表3 I2-KI染色法測定穿心蓮花粉活力Table 3 The results for the vitality of Andrographis paniculata pollen determined by I2-KI staining method （n=3）

圖1 穿心蓮花粉I2-KI染色結(jié)果（×100）Figure 1 The I2-KI staining results for Andrographis paniculata pollen（×100）

表4 TTC法測定花粉活力Table 4 The results for the vitality of Andrographis paniculata pollen determined by TTC method（n=3）

圖2 穿心蓮花粉TTC染色結(jié)果（×100）Figure 2 The TTC staining results for Andrographis paniculata pollen（×100）

從直觀分析可得，4個因素對穿心蓮花粉管萌發(fā)率的影響從大到小的排列為：蔗糖質(zhì)量濃度＞硼酸質(zhì)量濃度＞氯化鈣質(zhì)量濃度＞PEG6000質(zhì)量濃度。試驗得出的最佳組合是A1B2C2D3，即蔗糖100 g/L、氯化鈣0.3 g/L、硼酸1.0 g/L、PEG6000 150 g/L。對最佳組合進(jìn)行驗證試驗，穿心蓮花粉萌發(fā)率為82.5%，高于上述9組試驗的萌發(fā)率。對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

由表6可知，A因素（蔗糖）、B因素（氯化鈣）、C因素（硼酸）對穿心蓮花粉萌發(fā)有顯著性意義（P＜0.05），其中A因素（蔗糖）具有非常顯著性意義（P＜0.01）。

2.3.2 GA3質(zhì)量濃度對花粉管離體萌發(fā)的影響 以上述正交試驗得出的最佳組合（蔗糖100 g/L，氯化鈣0.3 g/L，硼酸1.0 g/L，PEG6000 150 g/L）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液配方，分別加入 0.001、0.01、0.1 g/L GA3，考察不同質(zhì)量濃度GA3對花粉管萌發(fā)的影響。試驗結(jié)果見表7。

由表7可知，加入不同質(zhì)量濃度GA3后，花粉管萌發(fā)率與對照組相比，花粉萌發(fā)率沒有顯著增高，但是通過觀察，發(fā)現(xiàn)花粉萌發(fā)的時間大大縮短。加入GA3后，花粉管畸形化、彎曲化嚴(yán)重，不利于花粉管的觀察與統(tǒng)計。

2.3.3 預(yù)處理對花粉管離體萌發(fā)的影響 采用正交試驗設(shè)計統(tǒng)計得出的最佳培養(yǎng)液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取即將盛開或已盛開的小花，分別進(jìn)行4℃冷預(yù)處理24、48 h，30℃熱預(yù)處理24、48 h，不做處理的為對照組，剝?nèi)』ǚ圻M(jìn)行培養(yǎng)，試驗結(jié)果見表8。

表5 穿心蓮花粉管離體萌發(fā)試驗結(jié)果Table 5 In-vitro test results for Andrographis paniculata pollen tube germination （n=5）

表6 花粉管離體萌發(fā)正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis for orthogonal test of in-vitro germination of pollen tube

表7 GA3質(zhì)量濃度對花粉管離體萌發(fā)的影響Table 7 Effects of different GA3 concentrations on in-vitro pollen tube germination （n=3）

由表8可知，與對照組（不處理）比較，4℃冷處理24 h能顯著提高花粉管萌發(fā)率。4℃冷處理48 h與30℃熱處理24 h的穿心蓮花粉管萌發(fā)率與對照組比較，無顯著性差異。但通過30℃熱處理48 h組可得出，隨著熱處理時間的增長，花粉管萌發(fā)率下降，花粉活力降低。

表8 預(yù)處理對花粉管離體萌發(fā)的影響Table 8 Effects of pretreatments on in-vitro pollen tube germination （n=3）

2.3.4 光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)對穿心蓮花粉管萌發(fā)的影響 采用正交試驗設(shè)計統(tǒng)計得出的最佳培養(yǎng)液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取經(jīng)24 h 4℃預(yù)冷處理的即將盛開或已盛開的小花，剝?nèi)』ǚ?，在?5±2）℃配合2 000 Lux光照（光照10 h，黑暗14 h）條件下培養(yǎng)24 h。在顯微鏡下觀察花粉管萌發(fā)情況，試驗結(jié)果見表9。對表9試驗結(jié)果進(jìn)行分析，光培養(yǎng)與暗培養(yǎng)對穿心蓮花粉管萌發(fā)無顯著影響（P＞0.05）。

2.3.5 花粉管萌發(fā)法測定穿心蓮花粉活性 采用正交試驗設(shè)計統(tǒng)計得出的最佳培養(yǎng)液，均勻滴在凹形載玻片中間。分別在8:00、15:00 2個時間段采集藥絲比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的4種小花。4℃預(yù)冷處理24 h后，剝?nèi)』ǚ?，進(jìn)行培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察花粉管離體萌發(fā)情況，試驗結(jié)果見表10，圖3、4。

表9 光照條件對花粉管離體萌發(fā)的影響Table 9 Effects of lighting conditions on in-vitro pollen tube germination （n=3）

表10 花粉管萌發(fā)法測定穿心蓮花粉活性Table 10 The results for Andrographis paniculata pollen activity determined by pollen tube germination method （n=3）

由表10可知，8：00與15：00 2個時間點采集的4個生長時期花粉統(tǒng)計結(jié)果均以藥絲比為1∶6的花粉管離體萌發(fā)率最高，即該時期花粉活力最強(qiáng)；藥絲比為1∶1時花粉管萌發(fā)率最低，即該時期花粉活力最低。花粉管離體萌發(fā)率均隨著藥絲比的減小而呈增高趨勢。但是對2個采集時間比較顯示，8：00采集的4種藥絲比的小花的花粉管離體萌發(fā)率均比15：00時采集的高，所以在8：00采集藥絲比為1∶6的小花即可獲得花粉活力最高的小花。

3 討論

圖3 穿心蓮花粉萌發(fā)過程（×400）Figure 3 The germination process of Andrographis paniculata pollen tube（×400）

圖4 培養(yǎng)24 h后穿心蓮花粉管形態(tài)（×100）Figure 4 The morphology feature of Andrographis paniculata pollen tube after 24-h culture（×100）

花粉體外萌發(fā)法是花粉活力鑒定常用的方法，其方法簡便，萌發(fā)條件易控制[13-16]?；ǚ勖劝l(fā)一般需要碳水化合物，最常用的是蔗糖[17，18]，一方面保持滲透壓，另一方面作為新陳代謝的底物，提供能量。硼和鈣對于花粉管的伸長和生長液具有明顯的促進(jìn)作用[19-21]。同時也可以使用PEG6000調(diào)節(jié)穿心蓮花粉的滲透壓[22-26]，有助于穿心蓮花粉管的萌發(fā)。

本研究中，TTC法測定的花粉活力趨勢與花粉管離體萌發(fā)法測定的花粉活力趨勢相同，均為花粉活力隨著藥絲比的減少而呈增高趨勢。但在小花采集時間的測定上兩者結(jié)果不一致，通過TTC法測定，最佳活力的小花為15：00采集的藥絲比為1∶6的小花，但通過花粉管萌發(fā)法測定的結(jié)果則為8：00采集的藥絲比為1∶6的小花。由于TTC法原理是通過測定脫氫酶活性從側(cè)面反映花粉活性，所以試驗結(jié)果可能會存在偏差[27-30]，而花粉萌發(fā)法則是通過花粉管是否萌發(fā)直接反映花粉活力的，所以試驗結(jié)果較TTC法可信。TTC法的檢測時間較短，而花粉管萌發(fā)法則需要8～24 h的培養(yǎng)時間，檢測時間較長，因此TTC法在快速檢測花粉活性上具有優(yōu)勢，但是精確研究花粉活性仍應(yīng)選擇花粉管萌發(fā)法。

I2-KI染色法比起上述2種檢測方法，其原理是通過對花粉內(nèi)淀粉進(jìn)行染色從而判定花粉活力，但是花粉內(nèi)所含淀粉量與花粉活力之間的聯(lián)系目前尚未明確[31-35]，因此使用該方法測定花粉活性，可能會存在較大的偏差，不建議使用。