Keap1-Nrf2/ARE信號通路在腫瘤中的雙重作用及其與耐藥性的關(guān)系

李曉強(qiáng)，隋峰，王洋，趙麗鳳，李慧杰，譚余慶

中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京100029

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的重大致死疾病，隨著人類居住環(huán)境的惡化，惡性腫瘤的種類越來越多，隨之產(chǎn)生的腫瘤耐藥性等問題也越來越受到研究者的重視。Keap1-Nrf2/ARE 信號通路是機(jī)體在抵抗外來應(yīng)激時最重要的內(nèi)源性氧化應(yīng)激通路，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶等蛋白在保護(hù)正常細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[1]。但與此同時，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路對某些腫瘤細(xì)胞也表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而對另外某些腫瘤細(xì)胞卻表現(xiàn)出抑制作用，這種雙重作用使得以Keap1-Nrf2/ARE 信號通路為作用靶點的藥物研發(fā)必須得到足夠的重視。我們就Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的雙重作用及其在腫瘤耐藥性中的影響做簡要綜述，為以此信號通路為作用靶點的藥物研發(fā)提供新思路。

1 Nrf2、Keapl、ARE的基本結(jié)構(gòu)

1.1 Nrf2的結(jié)構(gòu)

核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2 re?lated factor 2，Nrf2）屬于Cap-n-Collar（CNC）蛋白家族，該家族成員均具有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZip）結(jié)構(gòu)[2]?；谄浔Ｊ匦蛄?，Nrf2 分為7個結(jié)構(gòu)功能域（圖1），即Neh1～Neh7（Nrf2-ECH homology）[3-4]。Neh1 結(jié) 構(gòu)域包含bZIP 結(jié)構(gòu)，其與細(xì)胞核內(nèi)小Maf 蛋白形成異源二聚體，使Nrf2 能夠識別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE），繼而啟動下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[5]。Neh2 結(jié)構(gòu)域含有2個重要保守區(qū)域DLG和ETGE，是Nrf2與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）結(jié)合的區(qū)域，正是基于這2個區(qū)域與Keap1的相互作用，才使得Nrf2 能夠穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)[6]。位于C端的Neh3 結(jié)構(gòu)域?qū)rf2的轉(zhuǎn)錄活性非常重要，該蛋白最后16個氨基酸殘基的缺失會完全破壞其激活報告基因和內(nèi)源性基因表達(dá)的能力[7]。Neh4和Neh5 結(jié)構(gòu)域是Nrf2的2個獨立激活區(qū)，它們分別與cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）結(jié)合，并與之協(xié)同作用起到活化轉(zhuǎn)錄的作 用[8]。Neh6 包 含2個 模 序，即DSGIS和DSAPGS，是一段非依賴于Keap1 調(diào)控Nrf2 降解的結(jié)構(gòu)域[9]。Neh7 是新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域，可特異性地與維甲酸X 受體α（retinoid X receptor α，RXRα）作用從而抑制Keap1-Nrf2/ARE 信號通路[3]。

1.2 Keap1的結(jié)構(gòu)

Keap1 是Cullin3與泛素連接酶E3 復(fù)合物的底物結(jié)合蛋白，該復(fù)合物可識別Nrf2，也可作為細(xì)胞外源性物質(zhì)和氧化應(yīng)激的傳感器[10]。Keap1屬于Kelch 家族多區(qū)域阻遏蛋白，包含5個主要的功能結(jié)構(gòu)域（圖1），分別為N端結(jié)構(gòu)域（N-termi?nal region，NTR）、干 預(yù) 區(qū)（intervening region，IVR）、BTB（broad complex, tramtrack and Bric-a-Brac）區(qū)、雙甘氨酸重復(fù)區(qū)（double glycine repeats，DGR）和C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal region，CTR）。其中DGR 區(qū) 也叫Kelch 區(qū)，是Keap1與Nrf2的Neh2部位結(jié)合區(qū)[11]。

圖1 Nrf2和Keap1 結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 ARE的結(jié)構(gòu)

ARE 是一種順式作用元件，核心序列為5'-（G/A）TGA（G/C）nnnGC（G/A）-3'。研究證實，Bach1和Nrf2 互相競爭結(jié)合ARE，從而調(diào)節(jié)ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)[12]。

2 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控機(jī)制

在正常生理狀態(tài)下，Nrf2 通過其Neh2 結(jié)構(gòu)域與負(fù)調(diào)控蛋白Keap1的Kelch 區(qū)相互作用，穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，Nrf2 經(jīng)泛素蛋白酶體途徑被降解，因此Nrf2的表達(dá)水平得以維持在較低的水平，機(jī)體處于一個氧化-抗氧化平衡的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到活性氧（ROS）或其他親核劑刺激后，Nrf2與Keap1 解偶聯(lián)，活化的Nrf2 轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞核，與小Maf 蛋白結(jié)合成異質(zhì)二聚體后與ARE 結(jié)合，激活靶基因表達(dá)，調(diào)控Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶等蛋白的轉(zhuǎn)錄活性（圖2）[13]，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用，使細(xì)胞恢復(fù)氧化-抗氧化平衡狀態(tài)。

Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的激活主要取決于Nrf2的激活，而Nrf2的激活主要由Keap1 介導(dǎo)及Nrf2 自身的磷酸化等調(diào)控。目前，由Keap1 介導(dǎo)的Nrf2 激活機(jī)制有一種比較流行的學(xué)說，即所謂的“鉸鏈和門閂”機(jī)制[14-15]。該機(jī)制認(rèn)為以二聚體形式存在的Keap1的2個DGR 區(qū)通過與Nrf2的DLG和ETGE 結(jié)構(gòu)域錨定在一起。親和力相對高的ETGE 區(qū)和親和力相對弱的DLG 區(qū)分別扮演著“鉸鏈”和“門閂”的角色。氧化應(yīng)激等刺激使得Nrf2的DLG 區(qū)與Keap1的DGR 區(qū)解 離，而Nrf2的ETGE 區(qū)仍然與Keap1的DGR 區(qū)穩(wěn)定結(jié)合在一起，使得Keap1-Nrf2 復(fù)合物穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)；而同時新生成的Nrf2的ETGE 區(qū)由于無法和Keap1 結(jié)合，從而在細(xì)胞質(zhì)中累積并陸續(xù)轉(zhuǎn)入核內(nèi)與Maf蛋白結(jié)合成二聚體，進(jìn)而結(jié)合ARE 促進(jìn)下游相關(guān)靶基因的表達(dá)。

另外，還有一些學(xué)者認(rèn)為一些蛋白激酶使Nrf2 發(fā)生磷酸化，致使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而促使Nrf2與Keap1 發(fā)生解離。例如，蛋白激酶C（PKC）可使Nrf2的Ser40 位點發(fā)生磷酸化，從而改變Nrf2的構(gòu)象，避免E3 泛素化連接酶對Nrf2的識別而阻礙降解，增加其在細(xì)胞質(zhì)中的含量并且增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[16]。

3 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在腫瘤發(fā)展中的雙重作用

3.1 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路對腫瘤的抑制作用

正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1 結(jié)合并處于活性相對抑制狀態(tài)。當(dāng)用一些外源物質(zhì)處理正常細(xì)胞時，引起Nrf2與Keap1 解偶聯(lián)，激活此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并啟動靶基因如醌氧化還原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、血紅素氧合酶1（HO-l）等的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，提高了細(xì)胞的氧化應(yīng)激及修復(fù)功能，避免了腫瘤的發(fā)生[17]。

圖2 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路

Keap1-Nrf2/ARE 信號通路能防止正常細(xì)胞發(fā)生癌變，使某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Wang 等合成了一種新的化合物PBQC，發(fā)現(xiàn)其高濃度條件下可通過增強(qiáng)Nrf2 活性從而抑制HeLa、A549、U87和HUVECs 等腫瘤細(xì)胞生長，而不抑制正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。此外，PBQC 可以引起Keap-1蛋白s-谷胱甘肽?；?，促進(jìn)Nrf2 核易位和促凋亡基因的表達(dá)，從而使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。

這些研究結(jié)果表明Keap1-Nrf2/ARE 信號通路對某些腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，其機(jī)制主要是通過增強(qiáng)Nrf2的活性，促進(jìn)其核異位來誘導(dǎo)相關(guān)保護(hù)蛋白抵抗正常細(xì)胞發(fā)生惡變的能力，同時提高腫瘤細(xì)胞中某些促凋亡蛋白的表達(dá)進(jìn)而促使其發(fā)生凋亡。

3.2 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路對腫瘤的促進(jìn)作用

臨床研究統(tǒng)計分析表明，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Nrf2的異常高表達(dá)會促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌、喉癌、肝癌細(xì)胞SMMC-7721 等的發(fā)展[19-21]。

CDK20 是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶，在多種癌癥的細(xì)胞生長和增殖中發(fā)揮重要作用，研究證明CDK20 通過自身保守的ETGE 結(jié)構(gòu)域與Nrf2 競爭結(jié)合Keap1，從而增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性，降低細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的放化療耐藥性[22]。這些發(fā)現(xiàn)說明Keap1-Nrf2/ARE 信號通路能促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展，其機(jī)制主要通過增強(qiáng)Nrf2的活性，進(jìn)而增強(qiáng)下游抗氧化蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)細(xì)胞抵抗外來應(yīng)激及其耐藥性的能力。

4 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路介導(dǎo)的腫瘤耐藥性

腫瘤耐藥性（multidrug resistance，MDR）是影響腫瘤化療效果的絆腳石。MDR的形成機(jī)制非常復(fù)雜，目前大多數(shù)研究表明這些機(jī)制主要包括多藥耐藥性相關(guān)蛋白（multidrug resistance associ?ated protein，MRP）等膜轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的化療藥物外排、GST 同工酶介導(dǎo)的化療藥物外排、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的MDR表達(dá)水平改變、凋亡途徑相關(guān)基因表達(dá)下降等[23]。越來越多的研究證實MDR與Keap1-Nrf2/ARE 信號通路密切相關(guān)，這與其能間接影響MDR 及相關(guān)酶的表達(dá)水平有關(guān)。

Hu 等發(fā)現(xiàn)位于細(xì)胞質(zhì)的新抗氧化因子iASPP（inhibitor of apoptosis stimulating protein of p53）不依賴p53，而通過其N端DLT 氨基酸序列與Nrf2經(jīng)典DLG 序列競爭性結(jié)合Keap1的DGR 結(jié)構(gòu)域，提高Nrf2 蛋白穩(wěn)定性，激活Nrf2 抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)其抗氧化靶基因（如NQO1、HMOX1、FTH1）表達(dá)，顯著抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和耐藥[24]。Tian 等發(fā)現(xiàn)，在膽管癌細(xì)胞中，非典型的蛋白激酶Cι（aPKCι）能夠促進(jìn)Nrf2 累積、核轉(zhuǎn)移及激活相關(guān)目的基因表達(dá)，從而促進(jìn)膽管癌的腫瘤發(fā)生和化藥耐藥性，這種作用是通過aPKCι與Nrf2 競爭結(jié)合Keap1 中一個高度保守的DLL 結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)的[25]。另外，其他一些蛋白如PALB2、DPP3 等也都可通過與Nrf2 競爭性結(jié)合Keap1 來促進(jìn)Nrf2 轉(zhuǎn)核，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境下的生存，增強(qiáng)其對化療藥物的耐藥性[26-27]。

這些研究結(jié)果表明，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，藥物通過競爭性結(jié)合Keap1 或Nrf2 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，激活Nrf2 并促進(jìn)其轉(zhuǎn)核，從而促使一些耐藥蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤的耐藥性。

5 基于Keap1-Nrf2/ARE 信號通路治療腫瘤的策略

化療在癌癥綜合治療中帶來的毒副作用和耐藥性是不容忽視的重要問題。鑒于Keap1-Nrf2/ARE 信號通路能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞耐藥性，抑制Keap1-Nrf2/ARE 信號通路已成為逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥的重要靶點之一。采用Keap1-Nrf2/ARE 信號通路抑制劑與抗癌藥聯(lián)用，增強(qiáng)癌細(xì)胞對化療藥的敏感性，改善化療藥物的治療效果，為癌癥治療提供了新途徑。

呂慧等的研究證實，多柔比星（DOX）可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞中Nrf2 蛋白累積，而聯(lián)合鴉膽子苦醇處理K562細(xì)胞可抑制Nrf2-Keap1 信號通路及其下游靶蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低K562細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，增強(qiáng)DOX誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡作用[28]。另外，從基因水平對Keap1-Nrf2/ARE 信號通路加以干擾或抑制，也可增敏腫瘤細(xì)胞。例如，研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA可與此信號通路中Keap1 或Nrf2 相互作用，從而抑制此信號通路的激活。Chang 等發(fā)現(xiàn)miRNA-141 可能通過靶向負(fù)調(diào)控Keap1 激活Keap1-Nrf2/ARE 信號通路，誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，以降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞T47D的活力[29]。還有一種可能是利用人工合成某些小分子多肽作為誘導(dǎo)劑[18]，這些多肽可以特異性結(jié)合Keap1 中DGR 結(jié)構(gòu)域或者Nrf2 中DLG 或ETGE 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，從而能破壞Keap1-Nrf2 復(fù)合物的穩(wěn)定性，促進(jìn)Nrf2與Keap1發(fā)生解離，進(jìn)而促使Nrf2 核異位促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)。

6 結(jié)語

Keap1-Nrf2/ARE 信號通路在機(jī)體抵抗外源性物質(zhì)和氧化損傷方面發(fā)揮著重要的作用，越來越多的研究證實，Keap1-Nrf2/ARE 信號通路與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。在癌癥治療中，Nrf2 有作為藥物靶點的巨大潛力，Nrf2誘導(dǎo)劑和NRF2 抑制劑都有望作為抗癌藥物發(fā)揮作用，其中一種可能是將Nrf2誘導(dǎo)劑或NRF2 抑制劑與傳統(tǒng)的抗癌藥物聯(lián)用[30]。但鑒于Keap1-Nrf2/ARE信號通路對腫瘤細(xì)胞的雙重作用，不同癌癥中Nrf2表達(dá)水平對癌癥的作用以及癌癥所處的發(fā)展階段都應(yīng)被考慮進(jìn)去[31]。長期使用Nrf2誘導(dǎo)劑是否會促使正常細(xì)胞發(fā)生惡變目前也尚未有確切定論，需要通過更深入的研究驗證。另外，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及到多種機(jī)制共同作用，仍須進(jìn)行更廣泛的研究加以理解。相信隨著對Keap1-Nrf2/ARE 信號通路的不斷深入研究，其在抗腫瘤方面也會發(fā)揮越來越重要的作用。