金針菇退化菌株復(fù)壯條件的優(yōu)化初探

李雪飛 佟希丹 李長田 付永平 宋 冰 李 玉

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金針菇退化菌株復(fù)壯條件的優(yōu)化初探

李雪飛 佟希丹 李長田 付永平 宋 冰*李 玉*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

金針菇在工廠化栽培的過程中，經(jīng)常出現(xiàn)菌種退化問題，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。試以金針菇的退化菌株為材料，通過組織分離、菌絲尖端分離的方法進(jìn)行復(fù)壯，通過接種在4種不同培養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行生長速度測定，篩選最適合金針菇復(fù)壯菌株生長的基質(zhì)，并考察不同光質(zhì)對復(fù)壯菌株生長的影響。結(jié)果表明：構(gòu)樹基質(zhì)可以促進(jìn)金針菇復(fù)壯菌株生長；相對于白光和紅光，藍(lán)光更有利于金針菇復(fù)壯菌株的生長，并在一定程度上提高了產(chǎn)量。

金針菇；退化菌株；復(fù)壯；培養(yǎng)基質(zhì)；光質(zhì)

金針菇（）又名構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢菌等[1-2]。其顏色有白色、褐色和淡黃色，是我國重要的栽培食用菌之一，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，且因獨(dú)特的口感和風(fēng)味，備受人們的喜愛。相比其他菇種，金針菇較早實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工廠化周年栽培。

金針菇生長過程中，需要適宜的溫度、濕度、光照和CO2等條件。其屬于厭氧型食用菌品種，對光照要求不嚴(yán)格，在光照或黑暗條件下均能形成子實(shí)體，而子實(shí)體形態(tài)和產(chǎn)量則有一定差異[3]。有研究表明，適宜的光質(zhì)（顏色）在一定程度上可以提高其產(chǎn)量[4-5]。

金針菇在工廠化栽培過程中，經(jīng)常出現(xiàn)菌絲老化、菌種退化，出菇不整齊，出菇延遲，產(chǎn)量嚴(yán)重下降。造成菌種退化的原因較多，包括核型改變、基因突變、菌株無性繁殖體感染病毒、細(xì)胞內(nèi)酶合成能力下降等，此外還有菌種自身遺傳多樣性、營養(yǎng)不良、無限傳代、長期低溫保藏等因素[6]。在金針菇工廠化栽培的過程中，感染病毒是造成菌種退化的主要原因之一。國內(nèi)外研究多次證實(shí)，感染病毒的金針菇會出現(xiàn)菌絲生長變?nèi)鮗7]、子實(shí)體褐化的現(xiàn)象[8]，并且由于病毒的潛隱期長、發(fā)病癥狀不明顯等導(dǎo)致病毒病害不易被察覺，一旦爆發(fā)將造成巨大的損失[9]。

菌種退化分為可逆和不可逆兩類，可逆的退化可通過提純復(fù)壯恢復(fù)優(yōu)良特性，生產(chǎn)上常采用菌絲尖端分離和原生質(zhì)體再生的方法進(jìn)行提純復(fù)壯[10]。研究表明，在金針菇工廠化栽培中使用組織分離法提純復(fù)壯效果顯著[11]；王玉、張沿江的研究均表明在食用菌菌種復(fù)壯過程中，更換培養(yǎng)基基質(zhì)后菌種活性和成活率均有提升[12-13]；張俊玲使用菌絲尖端分離法對金針菇菌株進(jìn)行復(fù)壯處理后收到顯著效果[14]。

本文以金針菇的退化菌株為主要試驗(yàn)材料，利用簡便易行的菌絲尖端分離法進(jìn)行復(fù)壯處理，并在不同培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，將獲得的復(fù)壯菌株在不同光質(zhì)下進(jìn)行出菇栽培實(shí)驗(yàn)，以期篩選獲得金針菇退化菌株適宜的復(fù)壯培養(yǎng)基和光照條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

退化菌株白色金針菇品種沈金2號和黃色金針菇品種川6號，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 培養(yǎng)基

（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基。①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，維生素B 10 mg/L，水1 000 mL，pH自然。②PDB液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，水1 000 mL，pH自然。

（2）復(fù)壯培養(yǎng)基。①CK培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，維生素B 10 mg/L，麩皮50 g/L，水1 000 mL。②構(gòu)樹培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，維生素B 10 mg/L，麩皮50 g/L，構(gòu)樹木屑10 g/L，水1 000 mL。③燕麥培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，維生素B 10 mg/L，麩皮50 g/L，燕麥10 g/L，水1 000 mL。④玉米粉培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO41.5 g/L，KH2PO43 g/L，維生素B 10 mg/L，麩皮50 g/L，玉米粉10 g/L，水1 000 mL。

1.3 組織分離法制備菌種

將兩個(gè)退化菌株分別進(jìn)行組織分離，在超凈工作臺內(nèi)取菌柄與菌蓋連接處的菌肉置于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，24 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)，獲取金針菇退化菌種待用。

1.4 菌絲尖端分離法復(fù)壯金針菇退化菌株

（1）用打孔器分別取兩退化菌株菌落邊緣菌塊（直徑0.5 cm）置于PDA培養(yǎng)基上，獲得白色品種復(fù)壯一代，黃色品種復(fù)壯一代。與此同時(shí)選取退化菌株中間菌落置于PDA培養(yǎng)基上，獲得白色原種和黃色原種，將所有接有菌塊的培養(yǎng)皿置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲的長勢。

（2）待菌落長到一定體積后，對黃色、白色復(fù)壯一代進(jìn)行菌絲尖端分離，獲得白色、黃色復(fù)壯二代；并對白色、黃色原種進(jìn)行擴(kuò)繁，置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲長勢。重復(fù)以上步驟，獲得復(fù)壯三代和同期原種。

1.5 測量不同培養(yǎng)基菌絲生長速率

用打孔器分別在所獲得的復(fù)壯三代和原種中取同一位置菌塊接種于提前準(zhǔn)備好的4種復(fù)壯培養(yǎng)基的正中央，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于24 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行避光培養(yǎng)。與此同時(shí)，采取十字交叉法劃線，連續(xù)一周每天測量菌落大小，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以便計(jì)算菌絲生長速率。

1.6 栽培出菇

將所獲得的退化菌株原種和白色、黃色復(fù)壯菌株在無菌條件下用打孔器取6～7個(gè)菌塊分別接種于提前準(zhǔn)備好的PDB液體培養(yǎng)基中，做好標(biāo)記，置于振蕩頻率為200 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6～7天獲得液體菌種，4 ℃下保存待用。

栽培瓶規(guī)格為直徑7 cm，高12 cm，裝料高壓滅菌冷卻后置于超凈工作臺上消毒接種，每瓶接入液體菌種約10 mL。接菌后，置于24 ℃下避光培養(yǎng)，待菌瓶菌絲長滿后，搔菌，移入出菇室的暗箱中進(jìn)行出菇管理。

出菇室溫度控制在15 ℃，空氣相對濕度80%～90％，同時(shí)設(shè)置白、紅、藍(lán)三色光處理，白色光為對照，每天光照時(shí)間8 h，觀察子實(shí)體的生長情況，記錄原基個(gè)數(shù)并進(jìn)行觀察。待子實(shí)體成熟后，測定菌柄長度、粗細(xì)、菌蓋直徑和單瓶產(chǎn)量等商品性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)壯培養(yǎng)基對復(fù)壯菌株生長的影響

通過比較金針菇復(fù)壯菌株與原種退化菌株在各培養(yǎng)基上的生長速率（表1）發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)樹培養(yǎng)基中各菌株菌絲生長速率均較快，兩個(gè)品種復(fù)壯之后菌絲生長速度明顯加快，且黃色品種菌絲生長速率較白色品種快，復(fù)壯效果更為明顯。

通過不同培養(yǎng)基菌絲長勢方差分析，得出構(gòu)樹培養(yǎng)基所對應(yīng)的Sig.=0.047<0.05，說明其對菌絲長勢具有顯著性影響，而玉米培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基對應(yīng)Sig.值均>0.05，說明對菌絲長勢均沒有顯著影響。

通過比對金針菇復(fù)壯菌株與原種退化菌株生長性狀（表2），可看出復(fù)壯菌株各性狀均有改良，其中子實(shí)體原基個(gè)數(shù)、生物學(xué)效率增加明顯。生物學(xué)效率相比原種退化菌株，黃色品種提高17%，原基數(shù)增加20個(gè)，子實(shí)體重增加2.2 g；白色品種提高13%，原基數(shù)增加12個(gè)，子實(shí)體重提高2.7 g。

2.2 不同光質(zhì)對復(fù)壯菌株的影響

通過比較金針菇復(fù)壯菌株與原種退化菌株在各光照處理下的子實(shí)體性狀（表3），得出兩個(gè)復(fù)壯菌株的各項(xiàng)性狀均優(yōu)于原種退化菌株，而藍(lán)光處理組子實(shí)體重和原基數(shù)目均優(yōu)于紅、白光處理。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究采用組織分離法和菌絲尖端分離法對菌株進(jìn)行復(fù)壯。將金針菇兩個(gè)品種分別置于4種復(fù)壯培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，并通過對菌絲生長速度的測量比對，得出結(jié)論：在復(fù)壯方法為菌絲尖端分離時(shí)，添加構(gòu)樹木屑的培養(yǎng)基菌絲生長速率較快。由此推測，構(gòu)樹木屑含有更有利于菌絲生長的營養(yǎng)成分，且金針菇黃色品種較白色品種復(fù)壯效果顯著。

復(fù)壯處理后對原種退化菌株和復(fù)壯菌株在不同光照下進(jìn)行出菇栽培實(shí)驗(yàn)，復(fù)壯菌株與原種退化菌株相比：黃色品種生物學(xué)效率提高17%，原基數(shù)增加20個(gè)，子實(shí)體重提高2.2 g；白色品種生物學(xué)效率提高13%，原基數(shù)增加12個(gè)，子實(shí)體重提高2.7 g。得出結(jié)論：金針菇復(fù)壯菌株的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于原種退化菌株，且在三色光中，藍(lán)色光照射處理的子實(shí)體重以及原基數(shù)量均有所提高，優(yōu)于白光、紅光的處理效果。

3.2 討論

目前，金針菇主要為工廠化周年栽培生產(chǎn)，若想保證其產(chǎn)量及質(zhì)量，就必須從源頭發(fā)現(xiàn)并及時(shí)解決問題，保證菌種的質(zhì)量。但由于菌種的長時(shí)間保存和多次擴(kuò)繁，均在一定程度上導(dǎo)致活力下降，影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量。為此需要對金針菇的菌種進(jìn)行復(fù)壯，增強(qiáng)其活力。

菌種退化除了病毒感染的原因外，還有營養(yǎng)不良、無限傳代、菌種保藏不當(dāng)?shù)仍騕15]。因此不能考慮單一因素，而要齊頭并進(jìn)，從小處著手。對退化菌種，可采取及時(shí)剔除、定期分離純化、創(chuàng)造適合的培養(yǎng)基質(zhì)及環(huán)境條件、控制菌種的傳代次數(shù)、更換不同的培養(yǎng)基質(zhì)等措施[16]。食用菌菌株的復(fù)壯方法主要有傳統(tǒng)的組織分離法、菌絲尖端分離法、原生質(zhì)體再生法等。相比原生質(zhì)體再生法，菌絲尖端分離法容易得到純的提純復(fù)壯的菌株；若將退化的菌株直接進(jìn)行原生質(zhì)體再生，無疑增加了篩選的工作量，也很難達(dá)到滿意的效果。本實(shí)驗(yàn)采用的菌絲尖端分離法具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、不需要特殊的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，目前最為常用。

本研究所進(jìn)行的栽培實(shí)驗(yàn)為小批量實(shí)驗(yàn)，初步斷定在金針菇的栽培過程中，藍(lán)色光源為有利光源，在一定程度上促進(jìn)生長，提高產(chǎn)量。但是光源應(yīng)用也需講究，否則會有相反的作用。2012年，佟希丹報(bào)道，不同品種在不同時(shí)期用不同光照照射不同時(shí)間，對金針菇的生長均有不同的影響[17]。在今后的研究中，應(yīng)考慮在金針菇生長不同時(shí)期的不同光照強(qiáng)度以及復(fù)合光的應(yīng)用。金針菇工廠化周年生產(chǎn)，把補(bǔ)充光源的范圍和密度作為一個(gè)變量考慮進(jìn)去，在保證節(jié)約能源的前提下可提高產(chǎn)量，增加收入。

表1 金針菇復(fù)壯菌株與原種退化菌株在各培養(yǎng)基上的生長速率比較

注：B1標(biāo)記為組織分離培養(yǎng)所得樣本白色退化菌株，B2標(biāo)記為組織分離培養(yǎng)所得樣本白色復(fù)壯菌株；H1標(biāo)記為組織分離培養(yǎng)所得樣本黃色退化菌株，H2標(biāo)記為組織分離培養(yǎng)所得樣本黃色復(fù)壯菌株；C1標(biāo)記為菌料中菌絲培養(yǎng)所得樣本白色退化菌株，C2標(biāo)記為菌料中菌絲培養(yǎng)所得樣本白色復(fù)壯菌株；M1標(biāo)記為菌料中菌絲培養(yǎng)所得樣本黃色退化菌株，M2標(biāo)記為菌料中菌絲培養(yǎng)所得樣本黃色復(fù)壯菌株。

表2 金針菇復(fù)壯菌株與原種退化菌株生長性狀比對

注：B1標(biāo)記為白色退化菌株，B2標(biāo)記為白色復(fù)壯菌株；H1標(biāo)記為黃色退化菌株，H2標(biāo)記為黃色復(fù)壯菌株。

生物學(xué)效率=（子實(shí)體鮮重/培養(yǎng)料干重）×100%。

“+”越多表示子實(shí)體整齊度越好。

表3 金針菇復(fù)壯菌株與原種退化菌株在各色光照處理下的子實(shí)體性狀

注：B1標(biāo)記為白色退化菌株，B2標(biāo)記為白色復(fù)壯菌株；H1標(biāo)記為黃色退化菌株，H2標(biāo)記為黃色復(fù)壯菌株。

“+”越多表示子實(shí)體整齊度越好。

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Preliminary study onoptimization of conditions for rejuvenation of degenerated strains of

Li Xuefei Tong Xidan Li Changtian Fu Yongping Song Bing*Li Yu*

（Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi, College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, JilinProvince, China）

Industrial cultivation ofstrains are often affected by degeneration leading to yield and quality loss. In this study, two degenerated strains ofwere used as starter materials from which rejuvenated strains were obtained by tissue and mycelial tip isolation technique. The most suitable media for reviving the growth of the degenerated strains was screened by measuring their growth rate on four different media, and the effects of different light quality on their growth were also investigated.The results showed that a media prepared fromin addition to blue light was the best in rejuvenating the growth of degenerated strains ofand increased their yield to a certain extent. This rejuvenation method will provide technical support for commercial production of, as well as in the preservation of strains.

; Degenerated strains; Rejuvenation; Illumination

S646

B

2095-0934（2019）01-052-05

長春市科技局資助項(xiàng)目(15SS11)，公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（No.201503137）；吉林省教育廳項(xiàng)目（No.JJKH20180670KJ）；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃資助項(xiàng)目（No.D17014）

，E-mail：yuli@126.com（李玉）；song19800123@126.com（宋冰）。