太子參環(huán)肽提取物對(duì)LQIS-COPD大鼠動(dòng)物模型的干預(yù)作用

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1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2. 福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonany Disease,COPD)，是以氣道不完全可逆性氣流受限為特征的疾病，與肺部對(duì)香煙、霧霾等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。COPD屬于中醫(yī)“喘證”、“肺脹”等范疇。病情長(zhǎng)期反復(fù)于緩解和急性發(fā)作之間，日益加重。中醫(yī)藥防治有悠久歷史，各醫(yī)家多以祛邪和補(bǔ)虛相結(jié)合的方法治療。急則治標(biāo)，急性發(fā)作期多以祛邪為主；緩則治本，穩(wěn)定期補(bǔ)虛，或攻補(bǔ)兼施。無論是在COPD急性期還是穩(wěn)定期，不僅止咳化痰平喘，還進(jìn)行全身整體調(diào)節(jié)，中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合均有著很好的療效，且副作用小[2-3]。

肺氣虛是COPD的始動(dòng)因素，并貫穿于整個(gè)病程。對(duì)氣虛的治療是COPD穩(wěn)定期的重要中醫(yī)治療策略[4]；肺氣虛的改善，可以有效減輕癥狀和減緩肺功能下降趨勢(shì)，對(duì)于多發(fā)、難治、具有反復(fù)發(fā)作特點(diǎn)的肺系疾病的綜合防治有積極作用[5]。太子參為石竹科植物孩兒參(Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.)的塊根。既能益氣，又可養(yǎng)陰，適用于脾肺虧虛氣陰不足者。以清補(bǔ)潤(rùn)燥見長(zhǎng)，在中醫(yī)治療慢性呼吸系統(tǒng)疾病中，為治療肺氣虛的核心藥物，使用頻次很高[6]。

太子參中所含化學(xué)成分種類繁多。其中，太子參環(huán)肽是由十多個(gè)氨基酸脫水縮合形成的環(huán)狀化合物，不僅具有能夠形成限制性構(gòu)像的特點(diǎn)，而且其抗化學(xué)降解和抗酶解的能力在生物體內(nèi)也強(qiáng)于線性肽，是一類有特色化學(xué)結(jié)構(gòu)的成分[7]，但活性并不明確。制備液相色譜能夠?qū)崿F(xiàn)在線檢測(cè)，具有高效分離的特點(diǎn)，其自動(dòng)化的程度比較高，操作簡(jiǎn)單，所得產(chǎn)品純度較高，在中藥制備分離方面得到了廣泛的應(yīng)用[8]。本文利用制備型高效液相制備分離環(huán)肽提取物，從肺氣虛證(Lung-qi Insufficiency Syndrome,LQIS)入手，探討太子參環(huán)肽提取物對(duì)COPD的干預(yù)作用，以活性為導(dǎo)向，發(fā)現(xiàn)太子參中藥效物質(zhì)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Shimazu LC-8A型制備液相色譜儀(Japan)，Waters e2695液相色譜儀，Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱、C18制備型液相色譜柱；Medlab生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易有限公司)，超聲霧化器(廣東粵華醫(yī)療器械有限公司)，生理體積描記盒(南京美易科技有限公司)，呼吸流量計(jì)(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)；MOKULYOD-230型冷凍干燥器；BARNSTEAD TⅡ型超純水機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 材料 太子參 [Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.]，購(gòu)于福建柘參種業(yè)有限公司，經(jīng)檢驗(yàn)符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體重(200±20) g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司出品。

色譜純?cè)噭杭状?德國(guó)Merck公司)，乙腈(美國(guó)Fisher公司)；分析純?cè)噭┚鶠閲?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品，水為電阻率為18.2Ω的超純水。

2 方法結(jié)果

2.1 太子參環(huán)肽提取物制備 稱取干燥一定重量的太子參藥材粉碎至20目，以10倍乙酸乙酯為溶劑，采用索氏提取法提取2次，每次3 h，過濾合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收乙酸乙酯，獲得干浸膏。取太子參乙酸乙酯干浸膏，以甲醇溶解，按本項(xiàng)目組專利方法進(jìn)行高壓制備色譜環(huán)肽提取物分離，采用制備型液相色譜柱、采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm；以乙腈—磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)餾分收集器收集餾分[9]。按如下方法檢視提取物特征。

2.2 環(huán)肽的檢識(shí)

2.2.1 薄層鑒別 按文獻(xiàn)方法[10]，取兩塊25 mm×50 mm的硅膠板G(板1和板2)，將樣品分別點(diǎn)在兩塊板上，用氯仿-甲醇(9∶1)展開揮掉溶劑后，板1放置，而板2懸于底部加有約1 mL 濃鹽酸的密閉的磨口玻璃缸中(耐酸和耐高溫玻璃缸)，置于已升溫至110℃的烘箱中，加熱水解1～2 h，冷卻后取出板2，在通風(fēng)柜中揮掉鹽酸然后將未經(jīng)水解的板1和加熱酸水解的板2 同時(shí)噴灑0.2%茚三酮丙酮試劑，用電吹風(fēng)加熱幾分鐘即可顯色。用上述方法重復(fù)操作一次，根據(jù)兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，板2在多數(shù)情況下顯示幾個(gè)紫紅色斑點(diǎn)，少數(shù)情況下顯示某些黃色斑點(diǎn)，而板1在相應(yīng)位置上無顯色斑點(diǎn)，由此提示樣品含有環(huán)肽或肽酰胺成分。

取50 mm×50 mm 硅膠G 板(板3)，按照雙向薄層層析板點(diǎn)樣方法將樣品點(diǎn)在板上，用氯仿-甲醇(9∶1)作第一向展開揮掉溶劑后，先按前述方法濃鹽酸高溫水解冷卻揮掉鹽酸后，然后在溶劑系統(tǒng)A(氯仿-甲醇-冰醋酸，8∶2∶2 滴)進(jìn)行第二向展開。揮掉溶劑后，板3噴灑0.2%茚三酮丙酮試劑，用電吹風(fēng)加熱幾分鐘斑點(diǎn)即顯出，按照上述方法再重復(fù)操作一次，板3在第二向的同一軸上顯示多個(gè)紫紅色或黃色斑點(diǎn)，確定樣品中含有環(huán)肽成分。

2.2.2 代表性環(huán)肽波譜數(shù)據(jù) 太子參環(huán)肽A，[M+H]+m/z 728.4346，分子式C37H57N7O8，摩爾質(zhì)量727.4269，二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)特征碎片離子m/z 分別為728.4354、710.4245、610.2519、310.2149、197.1280；太子參環(huán)肽B，[M+H]+m/z 779.4434，分子摩爾質(zhì)量778.4378，分子式C40H58N8O8，二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)特征碎片離子m/z 分別為779.4467、751.4508、405.2494。

2.3 藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)物造模 本實(shí)驗(yàn)采用《中醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》之“肺氣虛證”動(dòng)物模型制備方法，并復(fù)合木瓜蛋白酶霧化吸入，復(fù)制“LQIS-COPD”模型大鼠。正常組(空白對(duì)照)置于正常無煙環(huán)境中飼養(yǎng)；大鼠暴露于1 m3煙室中，用刨花/鋸末30 g，香煙每支燃約10 min，連續(xù)3支；另加SO2粉10 g，點(diǎn)燃煙熏；每日2次，每次1 h，并于造模開始后第30、32、34、36 天將超聲波霧化器與40 cm×40 cm×40 cm透明塑料箱相連，通過霧化管向箱中模型大鼠噴入0.3%的木瓜蛋白酶，每5只大鼠2 mL，造模期60 d。

2.3.2 分組給藥 Wistar 大鼠隨機(jī)分組，每組10只?？瞻讓?duì)照組、模型對(duì)照組造模結(jié)束后開始用生理鹽水灌胃10 mL/kg·d，同時(shí)霧化吸入生理鹽水4 mL/d；陽(yáng)性對(duì)照組，灌服桂龍咳喘膠囊：每天用藥劑量 1.25 mL/100g，以含生藥 0.09 g/mL 的藥液灌服；治療組，太子參環(huán)肽提取物高、中、低劑量(100 mg/kg/d、200 mg/kg/d、400 mg/kg/d)，灌胃給藥模型大鼠30 d。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 模型大鼠一般狀況 大鼠出現(xiàn)咳嗽、氣急、喘鳴、精神萎靡、行動(dòng)遲緩、蜷伏不動(dòng)、毛失光澤等癥狀，檢測(cè)一秒用力呼氣容積(FEV1)和用力呼氣量(FEV)，F(xiàn)EV1/FVC<70%、30%

2.4.2 大鼠肺功能測(cè)試 灌胃給藥結(jié)束第 2 天，以25 % 烏拉坦(4 mL/kg相當(dāng)于 1000 mg/kg)將大鼠麻醉后，切開頸部皮膚，分離氣管，行氣管插管。壓力換能器、呼吸流量計(jì)連接 Medlab 生物信號(hào)系統(tǒng)測(cè)出潮氣量、氣道流速、跨肺壓，經(jīng)數(shù)據(jù)處理得到肺氣道阻力(RL)和動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)。LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

分組RL /cmH2O/mL.sCdyn /mL/cmH2O空白對(duì)照0.0242 ± 0.00571.8702 ± 0.4588模型對(duì)照0.0404 ± 0.0048 ▲▲0.4648 ± 0.2694▲▲陽(yáng)性對(duì)照0.0299 ± 0.0065▽▽1.1174 ± 0.2794▽▽低劑量0.0307 ± 0.0039 *1.2502 ± 0.4995 **中劑量0.0302 ± 0.0076 *1.2588 ± 0.3721 **高劑量0.0295 ± 0.0055 **1.2610 ± 0.3372 **

注：模型組與空白對(duì)照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01; 陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較，▽P<0.05，▽▽P<0.01; 給藥組與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01 。

3 結(jié)論

LQIS-COPD大鼠給予太子參環(huán)肽提取物治療后，LQIS-COPD大鼠咳嗽、氣急、喘鳴的癥狀明顯改善。

模型組大鼠 RL 較空白對(duì)照組增加了 40.10%，而Cdyn則下降了 75.14%；桂龍咳喘膠囊陽(yáng)性對(duì)照組，較模型組 RL 下降了 25.99%，Cdyn 增加了140.40%。太子參環(huán)肽提取物400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg低、中、高劑量組， RL 分別下降了24.01%、25.25%、26.98%，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05～0.01)；而Cdyn 則分別增加了168.98%、170.83%%、171.30%，與模型組比差異較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。結(jié)果表明太子參環(huán)肽提取物高中低劑量均能明顯降低LQIS-COPD大鼠的肺氣道阻力，而顯著增加其肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性，太子參環(huán)肽提取物對(duì)肺氣虛證慢性阻塞性肺疾病模型大鼠具有良好的干預(yù)作用。

4 討論

COPD是一種常見疾病，吸煙或被動(dòng)吸煙是引發(fā)該疾病十分重要的因素。氣道阻力及氣流受限是COPD的發(fā)展進(jìn)程中的主要特征，氣道阻力的增加會(huì)導(dǎo)致肺內(nèi)殘留氣體過多，從而引發(fā)肺和胸廓的順應(yīng)性下降及呼吸功能障礙。本研究采用了RL及Cdyn兩個(gè)指標(biāo)，判定太子參環(huán)肽提取物對(duì)LQIS-COPD的干預(yù)作用，其中RL反映了大鼠大氣道的氣流阻力情況，而Cdyn則反映了大鼠小氣道的氣流阻力及胸廓和肺組織的彈性狀況。研究結(jié)果顯示，太子參環(huán)肽提取物對(duì)煙熏+木瓜酶蛋白造模所產(chǎn)生的氣道阻力升高及肺部動(dòng)態(tài)順應(yīng)性降低具有顯著的抑制作用，從而證明了太子參環(huán)肽提取物對(duì)肺氣虛證LQIS-COPD模型大鼠的干預(yù)作用。

COPD疾病易長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，且久病難以治愈，從而損傷肺氣。肺主氣，司呼吸，控制一身之氣生成，肺氣虛損則肺失治節(jié)，則氣機(jī)不暢，宗氣不足，營(yíng)衛(wèi)功能失調(diào)，從而外邪入侵，痞滿壅肺，引發(fā)咳嗽、肺脹、氣喘等現(xiàn)象。太子參補(bǔ)益肺氣具有潤(rùn)肺止咳之功效，本文從肺氣虛證入手，探討太子參益氣養(yǎng)陰的藥理作用；以活性為導(dǎo)向，探索環(huán)肽類特色物質(zhì)在太子參中所擔(dān)當(dāng)?shù)摹盎钚越巧?，?duì)于進(jìn)一步研究太子參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。