四種單增李斯特菌常用核酸檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)與應(yīng)用

紀(jì)順師，葉長(zhǎng)蕓

單增李斯特菌是一種革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧的食源性細(xì)菌[1]。該菌感染可引起李斯特菌病，主要癥狀為敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等，病死率高達(dá)20%～30%[2]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)鑒定方法是進(jìn)行細(xì)菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]，標(biāo)本中李斯特菌的檢測(cè)均需通過2次增菌、選擇性培養(yǎng)基分離和生化鑒定，整個(gè)過程需要5～7 d才能完成，耗時(shí)長(zhǎng)[3]。雖然現(xiàn)有核酸檢測(cè)方法能在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成目的基因的擴(kuò)增和檢測(cè)，但也存在一些不足。PCR方法需經(jīng)過擴(kuò)增、電泳以及凝膠成像等操作，耗時(shí)2～3 h且對(duì)儀器設(shè)備要求高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[4]。Real-time PCR方法能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)且不需要電泳和凝膠成像，但對(duì)儀器設(shè)備要求高且儀器價(jià)格昂貴[5]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和多交叉置換擴(kuò)增(MCDA)技術(shù)克服了以上劣勢(shì)[6]，在Bst酶的作用下，只需在某一恒定溫度(通常為60 ℃～65 ℃)下恒溫反應(yīng)1 h就可完成核酸擴(kuò)增過程，擴(kuò)增結(jié)果可通過染料顏色、濁度、電泳和膠體金標(biāo)記試劑條等多種形式進(jìn)行判斷，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求低且耗時(shí)少[7]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的針對(duì)單增李斯特菌特異基因lmo0733檢測(cè)的傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA 4種檢測(cè)方法的特異性、靈敏度進(jìn)行比較，并應(yīng)用于模擬單增李斯特菌污染標(biāo)本和市場(chǎng)采集的豬肉樣本的檢測(cè)，優(yōu)選出一種特異性好、靈敏度高、快速、高效，能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法，為肉制品單增李斯特菌的快速檢測(cè)及分離鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)選用了43株單增李斯特菌、22株非單增李斯特菌和15株非李斯特菌，其中單增李斯特菌參考菌株EGD-e用于比較方法的靈敏度，菌株信息見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株
Tab.1 Bacterial strains used in this study

菌株血清型菌株菌株來源菌株數(shù)量L.monocytogenens1/2aEGD-eATCC151772ATCC1Isolated strainsICDC101/2bBAA-2658ATCC1Isolated strainsICDC51/2c51779ATCC1Isolated strainsICDC53a51782ATCC1Isolated strainsICDC103bIsolated strainsICDC24a19114ATCC14b19115ATCC14c19116ATCC14d19117ATCC14e19118ATCC1710890NCTC1L.ivanoviiUBAA678ATCC1Isolated strainsICDC5L.innocuaUBAA680ATCC1Isolated strainsICDC10表1(續(xù))菌株血清型菌株菌株來源菌株數(shù)量L.grayiU25402ATCC1L.seeligeriU35967ATCC1L.welshimeriU35897ATCC1Isolated strainsICDC2Streptococcus suisUReference strainsICDC1S. faecalisUR. strainsICDC1S. oralisUR. strainsICDC1Enterobacter cloacaeUR. strainsICDC1S. pneumoniaeUR. strainsICDC1Salmonella paratyphiUR. strainsICDC1shigella dysenteriaeUR. strainsICDC1EnteropathogenicUR. strainsICDC1E. coliEnterotoxigenicUR. strainsICDC1E. coliEnteroaggregativeUR. strainsICDC1E. coliEnteroinvasiveUR. strainsICDC1E. coliEnterohemorhagicUR. strainsICDC1

aU，未知血清型；bATCC，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；NCTC，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)；ICDC，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。

1.1.2試劑與儀器 FRASER BROTH BASE、BRILLIANCETMLISTERIA AGAR BASE培養(yǎng)基(英國(guó)OXOID公司)；腦心浸液(北京陸橋技術(shù)有限公司)；細(xì)菌基因組提取試劑盒Bacteria Gene DNA kit(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；2×T5 Super PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司)；Premix Ex TaqTM II、 DL2000 DNA Marker(大連寶生物公司)；Loopamp○RDNA反應(yīng)試劑盒與Loopamp○R熒光檢測(cè)試劑(北京葵沫生物科技有限公司)；核酸恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒(北京甄敏生物科技有限公司)；引物合成由北京奧科生物技術(shù)公司完成。Rotor-Gene Q real-time PCR system (QIAGEN Inc, Germany) ；凝膠成像系統(tǒng) GEL Doc2000(美國(guó)Bio-rad公司)；Loopamp○R實(shí)時(shí)濁度儀LAG320C(榮研生物科技中國(guó)公司)。

1.1.3DNA模版的制備 實(shí)驗(yàn)菌株(表1)按照試劑盒說明書提取核酸，溶于100 μL Elution buffer中。實(shí)際豬肉樣本核酸提取步驟如下：取1 mL豬肉樣本Fraser增菌培養(yǎng)物，13 000 r/min離心3 min，棄掉上清液，加入200 μL無(wú)菌去離子水重懸，金屬浴100 ℃加熱10 min，13 000 r/min離心3 min，取上清液作為DNA模板-20 ℃保存。

1.2 方 法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 本研究中針對(duì)單增李斯特菌的特異基因lmo0733的傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的檢測(cè)引物參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，引物序列見表2。

1.2.2特異性驗(yàn)證 43株單增李斯特菌、22株非單增李斯特菌和15株非李斯特菌(表1)用于驗(yàn)證傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的特異性，每種方法每個(gè)反應(yīng)體系均加1 μL核酸作為模板，4種方法的具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[7-9]。

1.2.3靈敏度比較 將試劑盒提取的單增李斯特菌參考株EGD-e的DNA進(jìn)行倍比稀釋(10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、0.1 fg)，用于比較傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的檢測(cè)下限，每種方法均加1 μL倍比稀釋的核酸作為模板，且每個(gè)稀釋度至少重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

表2 本研究所使用的引物
Tab.2 Primers used in this study

方法引物序列(5′-3′)長(zhǎng)度參考來源普通PCRFCGCAAGAAGAAATTGCCATC 20nt[8]RTCCGCGTTAGAAAAATTCCA 20ntReal-time PCRFAATGCTTTATTGGCTATTTGTCTCG 25nt[9]RACTCCGATAACGCTAGTTTCAGG23ntProbeFAM-TGTGTGCCGTTATAGCAATAATTTCTGCG-BHQ-1LAMPF3AAATAGTCCTTACTTAGGTTGGGAT 25nt[9]B3CAGTAATTTTGAAGCCTGACTCATC25ntFIPCGGTGCTAATCTGACAAACAACCATTA-TAGTGATCCTGAAAC-TAGCGTT49merBIPATCCTTATAGGAGGAGTCGTTGGAACC-CAAAAGCATCAAACATAG-TACG49merLFCAAATGTATGAAAAGCTACTCCG23ntLBTTCTAACGCGGAAGAACGTATAA23ntMCDAF1AAGGACTTTCGCAAGAAGA19nt[7]CP1AGGAACTGACAGTCCTTGCTATCAAAC-TGAATGTGGTGC39merC1AGGAACTGACAGTCCTTGCT20ntD1CCCATTTAGAGATTGTTTGTC 21ntR1GGAGATTAACATATCGGAATC21ntR2GAAGTGCTTGAAACACCAGT20ntD2CAAAGGTTGATGATGTAAAAGC22ntC2CACTTTGCTTGGAGAAACTGTTATG25ntCP2CACTTTGCTTGGAGAAACTGTTATGAA-GTTTATAATCTC-CAGTTTTTCGG 50merF2GGCGGTCTTTCTTTGAGC 18nt

1.2.4模擬樣本的制備 市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮豬肉作為原始模擬樣本，稱取25 g采用歐標(biāo)方法(ISO11290-1:2017)進(jìn)行單增李斯特菌的分離培養(yǎng)鑒定，單增李斯特菌檢測(cè)陰性的豬肉樣本被認(rèn)為無(wú)單增李斯特菌污染，可用于制備模擬樣本。挑取參考株EGD-e單菌落接種到5 mL BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r/min增菌直至OD600達(dá)到0.6，吸取100 μL增菌液到900 μL PBS緩沖液中進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋。分別對(duì)不同濃度稀釋液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得到100 μL增菌液中含有的單增李斯特菌數(shù)量，取100 μL稀釋菌液與單增李斯特菌檢測(cè)陰性的25 g豬肉樣本混合制備成模擬樣本，模擬樣本中單增李斯特菌的終濃度分別為5×100CFU/25 g～5×108CFU/25 g。

1.2.5模擬樣本靈敏度檢測(cè) 制備的模擬樣本用50 mL PBS緩沖液浸泡反復(fù)揉捏幾次，將PBS沖洗液12 000 r/min離心10 min，棄上清液，保留沉淀，按照試劑盒說明書提取核酸。應(yīng)用傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法對(duì)模擬樣本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)每種方法的檢測(cè)靈敏度。

1.2.6歐標(biāo)方法(ISO11290-1:2017)檢測(cè)豬肉樣本中的單增李斯特菌 某豬肉零售市場(chǎng)不同攤位采集的50份豬肉樣本，取25 g豬肉樣本加入到225 mL的Half Fraser增菌液中，30 ℃，220 r/min，增菌24 h。然后取0.1 mL一次增菌培養(yǎng)物加入到10 mL Fraser 增菌液中，37 ℃，220 r/min，增菌36～48 h。用接種環(huán)取3環(huán)二次增菌產(chǎn)物，接種至李斯特菌顯色固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫孵育24～36 h，平板上挑取5個(gè)單增李斯特菌典型或可疑菌落，涂布于BHI平板進(jìn)行純培養(yǎng)，用于單增李斯特菌鑒定。

1.2.7核酸檢測(cè)方法檢測(cè)豬肉樣本增菌液培養(yǎng)物

取1 mL Fraser培養(yǎng)液中的增菌培養(yǎng)物提取DNA，13 000 r/min離心3 min，棄上清，加入200 μL去離子水重懸，100 ℃金屬浴加熱10 min，13 000 r/min離心3 min，取上清液作為模板，同時(shí)使用傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法進(jìn)行單增李斯特菌核酸檢測(cè)。

1.2.8歐標(biāo)檢測(cè)方法和4種核酸檢測(cè)方法對(duì)豬肉樣本分離單增李斯特菌檢出率比較 以“金標(biāo)準(zhǔn)”中歐洲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法得到單增李斯特菌陽(yáng)性的樣本作為參照，比較4種核酸檢測(cè)方法與歐洲標(biāo)準(zhǔn)方法的單增李斯特菌陽(yáng)性檢出率及一致性情況。

2 結(jié) 果

2.1引物驗(yàn)證 傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的檢測(cè)引物通過NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行特異性比對(duì)，結(jié)果顯示4種核酸檢測(cè)方法的引物(表2)均為單增李斯特菌特異。

2.2特異性的驗(yàn)證 43株單增李斯特菌、22株非單增李斯特菌和15株非李斯特菌(表1)用于傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法的特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示4種方法均能特異性擴(kuò)增單增李斯特菌。

2.3靈敏度結(jié)果 如圖1所示，對(duì)于單增李斯特菌參考株EGD-e倍比稀釋的核酸，傳統(tǒng)PCR方法的檢測(cè)下限為10 pg/反應(yīng)；Real-time PCR和LAMP方法的檢測(cè)下限均為100 fg/反應(yīng)，是傳統(tǒng)PCR方法靈敏度的100倍；MCDA方法的檢測(cè)下限為10 fg/反應(yīng)，是傳統(tǒng)PCR方法靈敏度的1 000倍，并且MCDA方法對(duì)于濃度為10 fg的核酸30 min內(nèi)即可檢測(cè)到。

2.4模擬樣本檢測(cè)靈敏度結(jié)果 如圖2所示，傳統(tǒng)PCR方法對(duì)于模擬污染豬肉樣本的檢測(cè)能力為5×103CFU/反應(yīng)；Real-time PCR和LAMP方法檢測(cè)模擬樣本的能力達(dá)到5×102CFU/反應(yīng)，是傳統(tǒng)PCR方法靈敏度的10倍；MCDA方法的檢測(cè)下限為5×101CFU/反應(yīng)，靈敏度為傳統(tǒng)PCR方法的100倍。因此，MCDA方法的對(duì)模擬樣本的檢測(cè)比其它3種核酸檢測(cè)方法靈敏。

(A) 普通PCR方法的檢測(cè)下限；(B) Real-time PCR方法的檢測(cè)下限；(C) LAMP方法的檢測(cè)下限，(D) MCDA方法的檢測(cè)下限。M，DL2000bp，DNA Marker。圖1 單增李斯特菌EGD-e菌株核酸檢測(cè)下限 Fig.1 LOD of four methods for nucleic acid of L. monocytigenes EGD-e

(A)普通PCR方法的檢測(cè)下限；(B)Real-time PCR方法的檢測(cè)下限；(C) LAMP方法的檢測(cè)下限，(D) MCDA方法的檢測(cè)下限。M，DL2000bp，DNA Marker。圖2 4種核酸檢測(cè)方法對(duì)模擬樣本核酸的檢測(cè)下限Fig.2 LOD of four nucleic acid detection methods for artificial contaminated samples

2.5歐標(biāo)方法對(duì)市場(chǎng)豬肉樣本中李斯特菌的檢測(cè)結(jié)果 通過對(duì)純培養(yǎng)的疑似單增李斯特菌菌落的鑒定，市場(chǎng)采集的50份豬肉樣本中有13份樣為單增李斯特菌陽(yáng)性，分離率為26%。

2.6核酸檢測(cè)方法對(duì)豬肉樣本增菌液培養(yǎng)物的檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA方法對(duì)50份豬肉樣本的二次增菌培養(yǎng)物核酸的檢測(cè)結(jié)果如表3所示。傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)到11份豬肉樣本單增李斯特菌核酸陽(yáng)性，Real-time PCR只檢測(cè)到4份單增李斯特菌陽(yáng)性樣本，LAMP檢測(cè)到15份樣本為單增李斯特菌陽(yáng)性，MCDA方法檢測(cè)到18份樣本為單增李斯特菌陽(yáng)性。其中MCDA方法檢測(cè)到的18份陽(yáng)性樣本包含了其它3種方法和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法得到的陽(yáng)性樣本。

隨后將MCDA方法檢測(cè)陽(yáng)性而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法檢測(cè)陰性的5份豬肉樣本的Fraser增菌液，使用另一種李斯特菌選擇培養(yǎng)基-阿洛糖增菌培養(yǎng)基[10]，進(jìn)行再次增菌分離培養(yǎng)。吸取1 mL Fraser增菌液到5 mL阿洛糖增菌液，35 ℃、220 r/min增菌30 h，涂布CM1080選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取疑似菌落進(jìn)行鑒定，結(jié)果5份樣本均分離到單增李斯特菌。因此，對(duì)50份豬肉樣本的檢測(cè)，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的單增李斯特菌陽(yáng)性率為26%，MCDA方法的陽(yáng)性率為36%。

3 討 論

單增李斯特菌是一種重要的食源性細(xì)菌，廣泛分布于自然界，常見于生冷食品。食用被單增李斯特菌污染的食品可導(dǎo)致嚴(yán)重的李斯特菌病，單增李斯特菌的發(fā)病率雖低但病死率高達(dá)20%～30%。因此，樣本中單增李斯特菌的快速檢測(cè)對(duì)于病例確診和及時(shí)治療很重要。

以往單增李斯特菌核酸檢測(cè)的靶基因通常是hlyA、actA、prfA等[11-12]，但有文獻(xiàn)[8,13]報(bào)道這些基因不僅存在于單增李斯特菌，也在其他李斯特菌屬細(xì)菌(如伊氏李斯特菌、希爾李斯特菌)中存在。目前l(fā)mo0733是被認(rèn)為是單增李斯特菌特有的基因，因此本研究對(duì)以該基因?yàn)榘袠?biāo)的核酸檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。

單增李斯特菌常用的核酸檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR，以及恒溫?cái)U(kuò)增為基礎(chǔ)的LAMP方法、MCDA方法。傳統(tǒng)PCR方法是實(shí)驗(yàn)室最常用的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，但擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)凝膠電泳成像才能讀取擴(kuò)增結(jié)果，整個(gè)過程耗時(shí)約2～3 h；Real-time PCR是在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上，增加熒光基團(tuán)和熒光檢測(cè)裝置，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，不需要凝膠電泳成像，但需要精密的儀器設(shè)備，價(jià)格較為昂貴；恒溫?cái)U(kuò)增方法能夠在恒溫條件下1 h內(nèi)能完成核酸的擴(kuò)增，對(duì)儀器的要求較低，擴(kuò)增結(jié)果可通過可視化等多種方式判讀。

表3 分離培養(yǎng)方法和四種核酸檢測(cè)方法對(duì)50份豬肉樣本單增李斯特菌分離結(jié)果
Tab.3Listeriamonocytogenesisolation results of culture method and four nucleic acid methods on 50 pork samples

樣本編號(hào)分離培養(yǎng)法普通PCR方法Real-time PCR方法LAMP方法MCDA方法1++++2++++5+++++9++10++21+++++37++++39+++42+++44+++++52++++54++++63++++66++++71+82+++++89+90+共計(jì)131141518分離率26%22%8%30%36%

注：傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和四種分子診斷方法檢測(cè)均為陰性樣未列出本；+：表示陽(yáng)性結(jié)果。

本文應(yīng)用的傳統(tǒng)PCR、Real-time PCR、LAMP和MCDA 4種核酸檢測(cè)方法均能準(zhǔn)確檢測(cè)單增李斯特菌。傳統(tǒng)PCR方法對(duì)50份生肉樣本的分離，核酸檢測(cè)陽(yáng)性的樣本為11份，而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法結(jié)果為陽(yáng)性的有13份，可能由于傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)靈敏度有限，增菌液中核酸量小于閾值導(dǎo)致假陰性結(jié)果；Real-time PCR方法對(duì)模擬樣本的檢測(cè)下限為5×102CFU/反應(yīng)，但實(shí)際樣本中只檢測(cè)到4份，可能與水煮法制備核酸法導(dǎo)致二次增菌液培養(yǎng)物中某些物質(zhì)未能去除，從而影響Real-time PCR方法的核酸擴(kuò)增效率或熒光的檢測(cè)有關(guān)；LAMP方法和MCDA方法在模擬樣本和實(shí)際樣本檢測(cè)中都有很好的特異性和靈敏性，LAMP方法檢測(cè)到15份單增李斯特菌陽(yáng)性生肉樣本，而MCDA方法檢測(cè)到18份單增李斯特菌陽(yáng)性樣本，提示生肉樣本的檢測(cè)中MCDA方法比LAMP方法更為靈敏。

本研究證實(shí)多交叉置換擴(kuò)增(MCDA)方法比其它3種核酸檢測(cè)方法更為快速、靈敏且實(shí)用性強(qiáng)，在單增李斯特菌監(jiān)測(cè)和單增李斯特菌疫情暴發(fā)時(shí)，應(yīng)用MCDA方法可對(duì)增菌液進(jìn)行快速篩檢，減少分離培養(yǎng)及鑒定的時(shí)間(通常為32～72 h)，節(jié)省人力和成本。因此，MCDA方法可作為快速篩檢的分子診斷方法應(yīng)用于肉制品樣本中單增李斯特菌的檢測(cè)。

利益沖突：無(wú)