線粒體功能障礙與角膜疾病研究進(jìn)展△

劉文鳳 朱佩文 邵毅

角膜是眼球前部的一種圓頂狀的透明結(jié)構(gòu)，是光學(xué)系統(tǒng)的重要組成部分，80%的折射率由它產(chǎn)生。正常角膜的結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)依次包括：上皮層、Bowman層、基質(zhì)層、Descemet膜、內(nèi)皮層[1]。角膜是透明無血管的，從淚膜、房水和角膜邊緣的血管中獲取營養(yǎng)[2]。獲取的營養(yǎng)物質(zhì)在角膜細(xì)胞線粒體內(nèi)經(jīng)氧化分解產(chǎn)生能量，以維持各種功能。自從Leber視神經(jīng)遺傳病被發(fā)現(xiàn)后，越來越多的研究表明線粒體功能障礙與眼部疾病，尤其是角膜疾病密切相關(guān)。

1 線粒體結(jié)構(gòu)和功能

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)由兩層膜包被的細(xì)胞器，直徑為0.5～1.0 μm，機(jī)體不同部位細(xì)胞所含線粒體數(shù)目差別很大。線粒體外膜光滑，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴，中央部分為基質(zhì)。基

質(zhì)中的線粒體基因組是一個(gè)與核DNA分離的封閉環(huán)狀分子，正常人線粒體DNA長16 569 bp，包含37個(gè)基因，其中13個(gè)基因編碼的酶對于大多數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphophate，ATP)的氧化磷酸化途徑至關(guān)重要[3]。

線粒體的主要功能是氧化糖類、脂肪和氨基酸，產(chǎn)生能量以供細(xì)胞利用。來自淚膜、房水、角膜邊緣的營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)編碼的各種酶的作用下，經(jīng)過三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，同時(shí)也產(chǎn)生熱能。除此之外，線粒體還具有協(xié)同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存鈣離子調(diào)控鈣離子水平、調(diào)節(jié)膜電位，并控制細(xì)胞程序性死亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝、合成膽固醇及某些血紅素等功能。

2 角膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙

角膜中主要有3種細(xì)胞：角膜上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)中的角質(zhì)細(xì)胞和高度分化的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。角膜上皮中央厚度約為50 μm，細(xì)胞新陳代謝高度活躍，每5～7 d更新1次?；|(zhì)是由緊密排列的平行膠原纖維和角質(zhì)細(xì)胞組成的一種有序排列的膠原質(zhì)組織，約占角膜的90%[4]。內(nèi)皮細(xì)胞為六邊形細(xì)胞，核大，胞內(nèi)含豐富內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，在保持角膜水合狀態(tài)和透明度方面起關(guān)鍵作用。

角膜高度暴露于自然界，接收大量高張力的大氣氧和陽光，包括紫外線(ultraviolet，UV)，導(dǎo)致角膜內(nèi)反應(yīng)性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成和細(xì)胞氧化損傷。由于mtDNA修復(fù)機(jī)制效率低、轉(zhuǎn)錄率高、缺乏組蛋白的保護(hù)以及位置鄰近生成大量ROS的線粒體內(nèi)膜，mtDNA尤其容易受到氧化損傷而突變。ROS是線粒體氧化磷酸化的副產(chǎn)物，它隨后會導(dǎo)致線粒體進(jìn)一步損傷，逐漸受損的線粒體會變得不那么有效，失去其功能完整性，釋放更多的ROS，從而加劇氧化損傷[5]。角膜ROS的過度積累影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞死亡。隨著年齡的增長，功能紊亂的線粒體逐漸積累，而線粒體功能障礙又進(jìn)一步導(dǎo)致mtDNA突變，形成一種“惡性循環(huán)”，最終導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失和細(xì)胞凋亡。UV還誘導(dǎo)過氧化氫分解，在角膜和皮膚中產(chǎn)生羥基自由基，這可能對DNA和脂質(zhì)等大分子造成損傷，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙。

當(dāng)然，角膜也配備了一個(gè)抗氧化防御系統(tǒng)來抵消自由基等氧化應(yīng)激的作用，這一系統(tǒng)包括低分子量抗氧化劑(維生素C、維生素E、胡蘿卜素、還原型谷胱甘肽和鐵蛋白等)和高分子量抗氧化劑[過氧化氫酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶等][6]。由于外界環(huán)境壓力的影響，抗氧化劑被逐漸消耗。并且隨著年齡增大，角膜抗氧化酶(SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶)的活性大大降低，而ROS生成的酶——黃嘌呤氧化酶活性僅略微下降，所以年齡也是角膜氧化防御失衡的原因之一。

3 線粒體功能障礙與角膜疾病

3.1遺傳性線粒體疾病線粒體疾病是指由細(xì)胞核DNA或mtDNA突變導(dǎo)致的以線粒體功能障礙為特征的一系列臨床疾病，通常具有遺傳性，如Kearns-Sayre綜合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)和Pearson綜合征[7-8]。KSS是一種罕見的神經(jīng)肌肉疾病，由mtDNA大片段缺失引起，缺失范圍為1000～10 000 bp，最常見的是缺失12個(gè)基因共4979個(gè)堿基對，也可在少數(shù)患者中檢測到A3243G點(diǎn)突變[9-10]。KSS臨床表現(xiàn)為上瞼下垂、眼外肌的漸進(jìn)性癱瘓、進(jìn)行性視網(wǎng)膜功能障礙和角膜內(nèi)皮功能障礙。KSS患者角膜上皮和基質(zhì)水腫導(dǎo)致視力下降、不適和疼痛。透射電鏡顯示，KSS患者角膜上皮細(xì)胞外觀為空泡狀，并伴有扭曲嵴的異常線粒體。角膜內(nèi)皮無氧糖酵解增加乳酸積累，高濃度的乳酸具有促凋亡效應(yīng)，可能加重角膜內(nèi)皮功能障礙。因此，角膜內(nèi)皮功能障礙是KSS的一個(gè)重要特征。

角膜內(nèi)皮功能障礙也被認(rèn)為是Pearson綜合征的眼部表型之一。Pearson綜合征多數(shù)由mtDNA的大量缺失或重排導(dǎo)致紅細(xì)胞酶缺陷引起，為常染色體顯性遺傳。在嬰幼兒期Pearson綜合征表現(xiàn)為難治性鐵幼粒細(xì)胞貧血癥、全血細(xì)胞減少癥、骨髓前體空泡化和胰腺外分泌功能紊亂，眼部表現(xiàn)為雙側(cè)薄霧狀角膜間質(zhì)、角膜增厚、角膜完全性上皮水腫和內(nèi)皮功能障礙。Pearson綜合征患者預(yù)期壽命顯著降低，但隨著年齡的增加，患者眼部臨床特征演變?yōu)镵SS[11]。

3.2圓錐角膜圓錐角膜是指角膜中央進(jìn)行性變薄、擴(kuò)張，使得角膜向前突出成錐形。該病嚴(yán)重程度可從近視、散光到嚴(yán)重的角膜圓錐形突出、瘢痕，甚至失明。大多數(shù)患者需要配戴復(fù)雜性的隱形眼鏡，20%的患者需要角膜移植，是導(dǎo)致年輕人角膜移植的主要原因。

Kenney等[12]對圓錐角膜的發(fā)生機(jī)制提出了以下假說：患者角膜中自由基代謝異常和氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、醛類和過氧亞硝酸鹽類潴留等原因使得角膜出現(xiàn)局部的變薄和突出。Pathak等[13]在20例圓錐角膜病例中進(jìn)行線粒體復(fù)合物Ⅰ基因測序，檢測出18例有非同義性突變和移位突變。De等[14]在圓錐角膜患者發(fā)現(xiàn)SOD1基因169+50delTAAACAG，表明SOD1基因也可能參與圓錐角膜發(fā)病機(jī)制。而Abuamero等[15]研究26例圓錐角膜患者組織，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)mtDNA突變一般不造成圓錐角膜，mtDNA突變累積到一定程度才發(fā)病。這些mtDNA突變會導(dǎo)致ROS水平升高，細(xì)胞對ROS的易感性也增加，增高的ROS可以通過提高角膜細(xì)胞降解酶活性和減少膠原合成等多個(gè)過程促進(jìn)圓錐角膜的發(fā)展。另外，免疫組織化學(xué)染色顯示圓錐角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)中存在，進(jìn)一步提供圓錐角膜中DNA氧化損傷的證據(jù)。

氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡尤其是前基質(zhì)細(xì)胞的凋亡，可造成角膜基質(zhì)變薄[16]。在電子顯微鏡可觀察到圓錐角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)囊泡變性和腫脹，同時(shí)也可觀察到多種凋亡相關(guān)分子的組織學(xué)特征和非典型表達(dá)，包括DNA斷裂、細(xì)胞收縮、凋亡小體的生成和染色質(zhì)凝聚、碎裂[17]。Galvis等[18]報(bào)道反應(yīng)性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)也參與了圓錐角膜的發(fā)病機(jī)制，Bowman層斷裂部位的血管內(nèi)皮一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)水平升高，NOS將精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮(nitric oxide,NO)，在這些角膜區(qū)域NO的生成增加，高水平過氧亞硝酸鹽、NO和ROS的細(xì)胞毒性作用會損害DNA，降低基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)水平，激活基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)。另外圓錐角膜中明膠酶A的活性增加，MMP和明膠酶A均為蛋白酶，能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分(如膠原蛋白Ⅳ、膠原Ⅴ、纖維蛋白和層蛋白)的消化[19]。Arnal等[20]發(fā)現(xiàn)圓錐角膜含有高水平的活性醛，如丙二醛和4-羥基-2-壬烯醛，它們是由脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的，并能破壞細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)。這些醛可引起溶酶體膜的改變，而溶酶體膜破裂也會釋放蛋白水解酶，從而激活細(xì)胞凋亡途徑。同時(shí)圓錐角膜中的抗氧化水平也可能改變，如抗氧化劑谷胱甘肽水平顯著降低?？傊?，mtDNA突變、DNA氧化損傷、NO和TIMP-1相關(guān)凋亡細(xì)胞凋亡增加，蛋白酶和活性醛相關(guān)的溶酶體水解酶的釋放、抗氧化劑水平的降低均可能參與圓錐角膜的發(fā)生和發(fā)展。

3.3Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD)是一種的漸進(jìn)性的雙側(cè)眼部疾病，特征是角膜內(nèi)皮細(xì)胞逐漸減少，角膜的水化能力降低，角膜透明性逐漸下降和視力下降。FECD發(fā)病率為4%，患者年齡多為30～50歲。FECD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素共同作用所致[21]。角膜內(nèi)皮細(xì)胞由于暴露于光照和其本身高代謝活動(dòng)，及缺乏自然再生能力，容易受到線粒體功能障礙和氧化損傷的影響。FECD患者的角膜組織ROS水平升高，氧化損傷程度的標(biāo)志物8-OHDG也較高。Wojcik等[22]報(bào)道與對照組相比，F(xiàn)ECD患者DNA損傷水平更高，DNA修復(fù)的有效性明顯低于對照組。DNA損傷(包括鏈斷裂、基底修飾和無堿基位點(diǎn)的氧化損傷)阻礙DNA聚合酶的作用，所以只有未受損的DNA模板才能參與聚合酶鏈反應(yīng)。因此，DNA擴(kuò)增與DNA損傷成反比，即病灶越多，擴(kuò)增幅度就越小[23]。而FECD患者大多數(shù)DNA損傷位于mtDNA中，表明mtDNA是氧化損傷的主要目標(biāo)。

FECD患者角膜氧化應(yīng)激增加將導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷、內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞凋亡。溫茜等[24]在動(dòng)物模型中利用UV-B刺激小鼠產(chǎn)生ROS，ROS的光氧化損傷作用誘導(dǎo)角膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而在FECD內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2下調(diào)，Nrf2介導(dǎo)的抗氧化防御反應(yīng)降低和p53相互作用誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[25]。Ziaei等[26]報(bào)道使用Nrf2的激動(dòng)劑環(huán)丁砜處理FECD患者角膜結(jié)果顯示，抗氧化分子過度表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)ROS減少，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也減少。

在FECD中，角膜抗氧化劑的正常生理也受到影響。FECD角膜細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析顯示，谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶、乙醛脫氫酶3A1、鐵蛋白、血紅素氧合酶、熱休克蛋白和過氧化物酶均下調(diào)。過氧化物酶和熱休克蛋白可能在FECD中發(fā)揮重要作用，因?yàn)樗鼈兌紖⑴c了細(xì)胞凋亡的過程。此外，F(xiàn)ECD患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞中SOD2和硫氧還蛋白還原酶也降低，而這些抗氧化酶的下調(diào)可干擾組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和FECD中凋亡通路的激活。總體來說，F(xiàn)ECD患者角膜細(xì)胞中mtDNA突變、細(xì)胞凋亡增加和抗氧化劑功能降低導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細(xì)胞代謝異常，并逐漸發(fā)展為功能障礙。

4 總結(jié)與展望

角膜是眼光學(xué)系統(tǒng)的重要組成部分，角膜相關(guān)疾病可能導(dǎo)致視力下降甚至喪失。本綜述總結(jié)了與氧化、抗氧化應(yīng)激失衡相關(guān)的3種角膜疾病，提供了氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙在遺傳性和后天性角膜病變發(fā)病機(jī)制中的作用日益明顯的證據(jù)。角膜的生理結(jié)構(gòu)使其本身易受氧化損傷的影響，氧化和抗氧化劑水平失衡會導(dǎo)致mtDNA突變，突變mtDNA可以隨著時(shí)間的推移不斷累積，一旦超過閾值，細(xì)胞產(chǎn)生能量障礙，將會出現(xiàn)疾病的臨床表型。

基于上述機(jī)制，可以使用抗氧化劑治療某些角膜疾病，如使用抗氧化性物質(zhì)抗壞血酸、維生素E、SOD、輔酶Q10保護(hù)線粒體功能，減少角膜損傷。隨著醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，人們對線粒體異常在角膜疾病中認(rèn)識逐漸加深，促進(jìn)了新的治療藥物的發(fā)展，未來可以靶向線粒體治療某些角膜疾病，預(yù)防或減少視力喪失。同時(shí)也應(yīng)關(guān)注線粒體功能障礙是否參與其他角膜疾病甚至角膜外的眼部疾病，從而為疾病治療提供新的方向。此外，mtDNA是母系遺傳，對患者進(jìn)行突變鑒定、提供遺傳咨詢來預(yù)防后代患遺傳性線粒體功能障礙相關(guān)角膜疾病也是很有必要的。