視神經(jīng)再生的實驗研究進展△

黃蓉 邢怡橋 李敏

視神經(jīng)在受到包括青光眼/外傷性視神經(jīng)病變(traumatic optic neuropathy，TON)以及各種缺血性、遺傳性、神經(jīng)性疾病等的視神經(jīng)損傷后通常無法

再生，繼而導致不可逆的視功能喪失[1]。近年來，受損視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)保護、視神經(jīng)再生修復的基礎研究方面有頗多進展。本文將對最近在視神經(jīng)再生方面的基礎研究進展綜述，以期從促進RGCs軸突再生的相關機制入手，為視神經(jīng)再生提供合理的理論基礎，有助于未來進一步研發(fā)促進神經(jīng)中樞神經(jīng)和軸突再生的方法。

1 視神經(jīng)損傷難以自身修復的機制

視神經(jīng)是RGCs軸突的延續(xù)，同時也屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，RGCs軸突不能再生的機制可能為視神經(jīng)損傷后RGCs自身的凋亡、缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子、成熟RGCs及其軸突喪失自身再生能力、缺乏合適的再生刺激信號、與軸突再生相關基因表達下調(diào)以及視神經(jīng)損傷局部的抑制性細胞外微環(huán)境等[1-3]。

同時，視神經(jīng)損傷后激活視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞，包括少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞以及視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞(retinal microglia cells，RMGs)，從而上調(diào)多種軸突生長抑制因子，即髓磷脂相關抑制分子如髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)、少突膠質(zhì)細胞-髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp)以及軸突生長抑制劑(neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A)等的表達[2]，促進由硫酸軟骨素、蛋白多糖組成的膠質(zhì)瘢痕形成，進一步形成了抑制軸突延伸的物理性屏障[4]。

此外，軸突損傷引起RGCs凋亡會通過上調(diào)P53信號通路下游因子，增加RGCs超氧化物水平，進一步引起RGCs凋亡[5]。

2 視神經(jīng)再生的基礎研究進展

視神經(jīng)損傷后修復的思路包括保護受損RGCs防止其死亡、誘發(fā)并促進損傷RGCs軸突再生、再生軸突到達正確的靶組織并重建突觸聯(lián)系以及視覺功能恢復4個步驟[6]。而近期視神經(jīng)再生方面基礎研究所取得的進展，重點包括通過適當炎癥刺激、提供神經(jīng)營養(yǎng)因子、激活成熟RGCs內(nèi)在能力再生、正確引導軸突克服抑制性細胞外環(huán)境等方面。

2.1炎癥刺激誘導視神經(jīng)再生Benowitz等[1]、Leibinger等[7]研究顯示晶狀體損傷及注射酵母多糖等方式能通過引起眼內(nèi)炎癥而誘導受損的RGCs顯著再生，而機制可能與RGCs內(nèi)在生長狀態(tài)的變化有關：晶狀體β、γ蛋白通過刺激星形膠質(zhì)細胞和Müller細胞，后兩者持續(xù)分泌睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neutrophic factor，CNTF)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，上述2種膠質(zhì)細胞源性細胞因子(glia-derived neurotrophic factor，GDNF)是促進RGCs存活和軸突再生的主要因子。Pasquin等[8]研究顯示，CNTF基因或CNTF/LIF基因敲除小鼠晶狀體損傷后促生長效果明顯下降，也說明CNTF、LIF在炎癥介導抑制軸突再生中必不可少。其通過磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin，P13 K/mTOR)、絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/ERK)等途徑調(diào)控下游調(diào)節(jié)蛋白合成和軸突生長細胞因子的釋放引起RGCs再生[9]。

此外，癌調(diào)蛋白(oncomodulin，Ocm)對介導炎癥刺激促進對視神經(jīng)再生起到了至關重要的作用[10]，Ocm是蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為11 000的鈣結合蛋白，在玻璃體和視網(wǎng)膜激活的巨噬細胞、中性粒細胞中高度表達。炎性刺激12～24 h后，Ocm水平迅速升高，并通過細胞內(nèi)信號傳導的第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，與RGCs高親和性受體結合[11]。因此，炎癥引起的 CNTF、LIF、IL-6相關因子釋放和包括JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR在內(nèi)的信號通路的調(diào)控被確認為是促視神經(jīng)再生的關鍵調(diào)控因素[8，12]。

2.2提供外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子RGCs依賴視神經(jīng)逆行軸漿運輸，從靶組織獲取各類營養(yǎng)因子。其中，神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTF)是在機體發(fā)育過程中介導神經(jīng)元細胞生長、分化、存活和突觸穩(wěn)定的蛋白，包括神經(jīng)營養(yǎng)家族、GDNF家族和其他生長因子[3]。一旦視神經(jīng)損傷引起來自靶組織的營養(yǎng)供應部分或完全阻斷，會導致視神經(jīng)潰變和RGCs凋亡[6]。

2.2.1神經(jīng)營養(yǎng)家族神經(jīng)營養(yǎng)家族包括4種蛋白多肽，即腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BNDF)、神經(jīng)生長因子、營養(yǎng)因子4/5(neurotrophin 4/5，NT4/5)和NT3，其通過與RGCs酪氨酸激酶受體結合發(fā)揮不同程度RGCs保護作用[10]。在實驗性視神經(jīng)損傷模型中，Osborne等[13]研究表明BNDF、NT4/5等神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)眼內(nèi)注射會導致RGCs存活時間暫時增加，但最終呈現(xiàn)下降趨勢；且同時抵消了眼內(nèi)炎癥對視神經(jīng)再生的促進作用。因而其神經(jīng)保護作用短暫，且不能阻止RGCs最終凋亡。

2.2.2GDNF家族GDNF家族包括CNTF和LIF，其是介導眼內(nèi)炎癥、促使軸突再生的關鍵因素，兩者均通過與含信號轉導受體的糖蛋白130結合來發(fā)揮作用[8]。Cui等[14]和Wen等[15]研究顯示視神經(jīng)損傷后，GDNF家族在刺激軸突長距離再生和促進軸突存活方面比神經(jīng)營養(yǎng)家族更有效。而Pemnet等[16]研究顯示視神經(jīng)損傷后CNTF和LIF高表達，通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制軸，調(diào)控發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)蛋白合成和軸突生長的因子mTOR來保護RGCs，同時促進軸突再生。此外，Leibinger等[7]、Kurimoto等[11]研究表明CNTF的保護作用與cAMP升高水平、眼內(nèi)炎性刺激和STAT3通路的激活狀況密切相關。

2.2.3其他生長因子其他生長因子則包括肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等[2-3]。Nakamura等[17]研究顯示HGF在體外和體內(nèi)均具有增加神經(jīng)元存活和軸突再生的作用。Soto等[18]研究發(fā)現(xiàn)FGF通過上調(diào)促進軸突生長的促蛋白生長相關蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)發(fā)揮作用。

2.3阻斷視神經(jīng)再生的細胞內(nèi)抑制性信號在發(fā)育過程中，神經(jīng)元軸突被特定信號導向靶組織。胚胎RGCs生長能力非常強，而發(fā)育晚期為穩(wěn)定突觸間相互聯(lián)系，中樞神經(jīng)元軸突的再生能力下降，但保留對軸突切斷的敏感性[9，19]，其可能機制是出生后早期基因表達發(fā)生變化，促使成熟CNS抑制性環(huán)境的形成以及發(fā)育依賴性的生長能力的下降[1，10]。

2.3.1調(diào)控特定基因的表達對于成熟RGCs而言，mTOR通路的激活具備促進神經(jīng)保護和軸突再生的能力，與細胞因子信號傳導抑制因子-3(suppression of cytokine signaling 3，SOCS3)和PTEN基因(phosphatase and tensin homologue，PTEN)的抑制下調(diào)密不可分[20]。因此，損傷后上調(diào)或下調(diào)特定基因的表達可能是增加軸突再生能力的方法之一[4]。

如上所述，SOCS3在成熟RGCs中表達上調(diào)，并通過抑制JAK/STAT3信號通路調(diào)控Ocm介導的軸突生長來下調(diào)RGCs自我再生能力。因此，SOCS3被認定是抑制軸突再生的關鍵負調(diào)節(jié)因子[21]。而RGCs中特定SOCS3基因敲除能促進軸突再生并強化CNTF眼內(nèi)注射的保護作用，再一次表明SOCS3是視神經(jīng)損傷后CNTF介導軸突再生的細胞內(nèi)抑制信號[22-23]。

PTEN是與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關的另一種內(nèi)源性軸突再生負調(diào)節(jié)因子，目前已被證實調(diào)控PTEN可增強神經(jīng)元自我再生能力，以促進損傷后RGCs的軸突再生[24]。此外，PTEN基因敲除可重新激活PI3K/AKT/mTOR通路，同時強化炎癥刺激誘導視神經(jīng)再生的作用[25]。因此，PTEN敲除結合炎性刺激以及cAMP類似物的添加對體內(nèi)軸突再生具有協(xié)同作用。理論上而言，多重敲除PTEN、SOCS3基因和抑制外源性CNTF表達可共同促進突再生[4，20]，但臨床實際操作中目前尚無法做到條件性基因敲除，因此此種方式目前未得到很好的應用。

2.3.2AAV2載體介導基因治療基因治療是促進視神經(jīng)再生的另一可觀手段，作為目前眼科基因治療應用最廣泛的轉基因載體，重組腺相關病毒2(adeno-associated virus2，AAV2)載體通過治療基因取代病毒編碼序列并轉染宿主細胞，以沉默PTEN基因表達，進而對RGCs存活和軸突再生體現(xiàn)出良好促進作用[26]。同時基因具有長時間表達的特點，因此通過玻璃體內(nèi)注射靶向重組AAV2達到視神經(jīng)保護的作用可能是未來的研究方向[26-27]。

2.3.3調(diào)控相關轉錄因子Krtippel類因子(Krtippel-like factors，KLFs)是一類翻譯因子，Moore等[28]研究顯示KLFs調(diào)節(jié)RGCs發(fā)育和再生的發(fā)育依賴性調(diào)節(jié)因子。Blackmore等[29]研究證實在RGCs發(fā)育過程中，胚胎RGCs軸突生長的抑制基因KLF-4和KLF-9表達上調(diào)，而促生長基因KLF-6和KLF-7表達下調(diào)，推測這可能與RGCs發(fā)育過程中表現(xiàn)出的發(fā)育性軸突生長能力喪失有關。Benowitz等[1]、Moore等[28]研究表明，敲除KLF-4基因后會通過調(diào)控JAK/STAT3信號通路促使視神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元生長和軸突再生。此外，Qin等[30]研究顯示由CNTF或SOCS3沉默引起的KLF-4缺失同樣會促使軸突再生顯著增加。

2.4細胞內(nèi)信號通路的激活wnt/β-catenin(Wnt)通路是機體內(nèi)用來調(diào)控細胞增殖的基礎通路，用以維持胚胎和組織發(fā)育的機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，因此是視網(wǎng)膜發(fā)育、軸突生長的重要信號傳導通路[31]。在發(fā)育性視網(wǎng)膜中，經(jīng)典Wnt配體Wnt3a、4、7b等能誘導軸突生長以及特異性調(diào)節(jié)RGCs軸突靶向投射。Patel等[32]研究顯示，通過玻璃體內(nèi)注射Wnt3a，發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)損傷實驗組RGCs存活率和軸突再生明顯增加，可能與其調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路激活轉錄因子STAT3有關。Patel等[33]研究顯示，圖形視網(wǎng)膜電圖(pattern electroretinography，P-ERG)檢查中wnt3a眼內(nèi)注射動物比對照組表現(xiàn)出更高的振幅，也進一步驗證了此觀點。

2.5改善抑制性視神經(jīng)細胞外微環(huán)境除了上述影響軸突再生的細胞內(nèi)抑制因子外，Shum等[3]、Chun等[34]研究表明，眾多細胞外因子共同作用為軸突再生營造了不利的細胞外微環(huán)境。因此，改善不利細胞外微環(huán)境在視神經(jīng)再生中則尤為重要。

2.5.1減少抑制性蛋白質(zhì)的合成視神經(jīng)損傷后，受損的RGCs軸突暴露在星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞變性并釋放的抑制性蛋白質(zhì)(如Nogo-A，MAG和OMgp)中[2，35]。大量實驗表明，Nogo-A、MAG和OMgp通過結合Nogo-66受體(Nogo receptor-1，NgRl)，并通過Ras同源基因A/rho相關蛋白激酶(RhoA/ROCK)信號途徑，誘導生長錐塌陷并抑制神經(jīng)元生長[4，10，16，34]，而Nogo受體基因缺失或基因敲除會誘導中等程度的視神經(jīng)再生[36]。損傷后活化的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞和RMGs肥大增生，在損傷部位形成膠質(zhì)瘢痕，分泌抑制細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子，包括硫酸軟骨素蛋白多糖(ehondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)和信號素，為軸突再生提供機械性屏障[37]。Kwok等[38]研究顯示，用細菌軟骨素ABC酶處理的方法，可降解硫代糖胺聚糖的側鏈，改善ECM瘢痕環(huán)境、促進軸突再生。

軸突細胞外抑制劑的作用信號通路主要集中于pA/p相關蛋白激酶(pA/ROCK)通路的激活，通過激活LIM蛋白激酶和絲切蛋白導致肌動蛋白解聚，進而肌動蛋白絲降解誘導生長錐失活或崩潰[39]。此外，視神經(jīng)損傷后pA信號的激活也能通過調(diào)控促存活蛋白(如AKT[26])合成促進軸突再生，并強化炎癥刺激在軸突再生中的促進作用[40]。Ohtake等[37]研究表明，ROCK失活能克服髓磷脂和CSPG在體外的抑制作用，使其在體內(nèi)RGCs中再生。近期Shaw等[41]研究顯示，ROCK/去甲腎上腺素轉運蛋白(Net)抑制劑在體內(nèi)視神經(jīng)損傷后促進RGCs存活和軸突再生，該研究表明AR-13324具有神經(jīng)保護作用和軸突再生作用，而含有AR-13324的滴眼液局部給藥，具有非侵入性、易吸收的特點，通過對ROCK/Net的抑制或許是克服視神經(jīng)再生障礙的又一新型治療方法。

2.5.2調(diào)節(jié)細胞離子濃度視神經(jīng)損傷后最早發(fā)生的現(xiàn)象之一是流動鋅(Zn2+)在無長突細胞中的快速增加，正常情況下[42]，Zn2+多集中在靶向神經(jīng)元突觸小泡中，并在調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜突觸信號傳遞中起關鍵作用。Ripps等[43]研究表明，視神經(jīng)受損后1 h內(nèi)Zn2+水平在視網(wǎng)膜無長突細胞中快速升高，在24 h達峰值，并轉移至受損RGCs。近期Li等[42]研究顯示Zn2+的螯合作用能使許多受損的RGCs得以存活數(shù)月、促進軸突再生，使得視神經(jīng)損傷后治療時間窗延長。上述結果表明，視網(wǎng)膜Zn2+失調(diào)將是影響RGCs存活和再生的前提與關鍵因素，考慮到Zn2+螯合劑已被臨床用于其他目的，視神經(jīng)損傷后玻璃體內(nèi)注射Zn2+螯合劑可能是視神經(jīng)再生的可能治療策略[42]。

另一視神經(jīng)損傷后的現(xiàn)象則是細胞外鈣離子(Ca2+)急劇增加，在機體損傷后28 d左右細胞內(nèi)Ca2+水平達到高峰，通過快速Ca2+通道介導流入RGCs軸突并激活鈣蛋白酶在軸突退化過程中發(fā)揮作用[44]。鈣通道阻滯劑早已被證明能減弱視神經(jīng)損傷后的急性軸突退化。此外，也能通過削弱鈣蛋白酶活性并通過激活視網(wǎng)膜AKT釋放促存活信號，在視神經(jīng)損傷后改善RGCs存活和軸突再生[45]。因此，單獨給予鈣通道阻斷劑或與上述任何其他抑制劑聯(lián)合治療，可為未來視神經(jīng)退變患者的治療提供新的思路。

2.6引導再生軸突到達正確的靶組織并重建突觸聯(lián)系胚胎發(fā)育時期的RGCs軸突組成的視神經(jīng)，半數(shù)在EphrinB2配體引導下于視神經(jīng)交叉處保持同側走行[46]。為了保正視覺空間定位，RGCs通過EphrinB2配體的濃度梯度來引導軸突精確投射到外側膝狀核、上丘腦以及特點大腦皮質(zhì)區(qū)域[1，34]。Abate等[47]研究顯示，EphrinB2配體信號在成熟哺乳動物視覺系統(tǒng)中穩(wěn)定表達，并在視神經(jīng)損傷后上調(diào)。但在軸突再生期間調(diào)控信號及其受體表達的機制尚不清楚，需要進一步研究[48]。De Lima等[25]研究顯示，通過酵母聚糖、cAMP類似物和PTEN基因敲除的聯(lián)合治療，能促使部分再生RGCs軸突延伸，并穿過視交叉進入小鼠模型的外側膝狀體中。而PTEN、SOCS3、CNTF基因聯(lián)合敲除雖然刺激了視神經(jīng)損傷部位的軸突再生，但只有少數(shù)軸突成功地跨越了視神經(jīng)交叉[1，49]。Li 等[50]研究進一步發(fā)現(xiàn)，當視交叉以上部分的視神經(jīng)損失時，PTEN、SOCS3、CNTF基因聯(lián)合敲除的方法能促進上丘腦中軸突再生并恢復突觸后反應；此外，c-myc癌基因的過表達同樣增強了上述效應，并允許較多軸突到達視束中[51]。

3 小結

視神經(jīng)損傷后有眾多信號通路、蛋白質(zhì)和轉錄因子等參與，表明促進視神經(jīng)再生的作用靶點并不單一。深入研究包括增強RGCs再生能力、改善外在生長抑制環(huán)境的因素、引導再生軸突到達正確的靶組織，并重建突觸聯(lián)系在內(nèi)的聯(lián)合治療，從而實現(xiàn)功能視覺恢復是未來研究熱點。

近年來，視神經(jīng)再生研究取得了巨大突破，已探清成熟RGCs軸突不能再生的分子機制，且研究出促進視神經(jīng)損傷后RGCs存活和軸突短距離再生的方法。理論上雖有使患者恢復光感的可能，但視覺功能性恢復需要更多的RGCs存活、更長距離的軸突再生以及后者精確投射至視覺中樞，并和中樞神經(jīng)元重建準確的突觸聯(lián)系。使得研發(fā)提高靶組織可塑性的方法任重而道遠，但最終恢復視神經(jīng)損傷患者的視覺功能將指日可待。