miR-29a抑制H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷

李海燕 郭琳 張倩 唐莉 馬波

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是導(dǎo)致老年人失明的主要原因。隨著人口老齡化的加劇，年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的數(shù)量逐年增加[1]。晶狀體上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能對于維持晶狀體的透明度至關(guān)重要[2]。氧化應(yīng)激是年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的重要調(diào)節(jié)因子，可引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)能夠破壞正常晶狀體上皮細(xì)胞的功能，導(dǎo)致白內(nèi)障的形成[3]。因此，抑制晶狀體上皮細(xì)胞的氧化損傷是預(yù)防白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)鍵。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類在人體內(nèi)廣泛分布、長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNAs。miRNAs主要通過與靶基因mRNA 3’端非編碼區(qū)結(jié)合，引起翻譯過程被抑制或者導(dǎo)致mRNA降解[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，mRNAs在白內(nèi)障的發(fā)病過程中具有重要作用。miRNA let-7b和miR-211在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜中異常表達(dá)，可調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[5-6]。Kubo等[7]的研究顯示，miR-29a在白內(nèi)障大鼠的晶狀體中表達(dá)下調(diào)，但是目前miR-29a在白內(nèi)障中的具體作用和機(jī)制還未見相關(guān)研究。H2O2是細(xì)胞內(nèi)主要的ROS，因此我們使用H2O2刺激人晶狀體上皮細(xì)胞，體外建立人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷模型，探究miR-29a對人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的影響，并探討其在白內(nèi)障發(fā)病過程中可能的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE-B3(美國ATCC公司)，DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清和2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA(美國Gibco公司)，H2O2(美國Sigma 公司)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞檢測試劑盒(美國BD公司)，CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、ROS檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(上海碧云天有限公司)，SuperQuick RT MasterMix和Super TaqMan Mixture(北京康為試劑生物科技有限公司)，TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan miRNA assay Kit試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，BCA法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，Bcl2修飾因子(Bcl2 modifying factor，BMF)抗體和Bcl2拮抗/殺傷因子1(Bcl2-antagonist/killer 1，BAK1)抗體(上海吉瑪基因公司)。miR-29a模擬物和對照模擬物序列由上海吉瑪基因公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組將HLE-B3細(xì)胞接種到含有體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長至90%融合時使用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。使用不同濃度(0 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1)的H2O2處理細(xì)胞，以確定后續(xù)實驗中的H2O2濃度。將細(xì)胞分成四組：對照組、H2O2組、H2O2+模擬物對照組和H2O2+miR-29a模擬物組。其中對照組不進(jìn)行任何處理，后三組均使用適宜濃度的H2O2處理，H2O2+模擬物對照組和H2O2+miR-29a模擬物組中分別轉(zhuǎn)染對照模擬物和miR-29a模擬物。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和H2O2處理將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，接種到特定的細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至70%融合時，按照試劑盒說明書操作轉(zhuǎn)染對照模擬物和miR-29a模擬物48 h后，加入一定濃度的H2O2培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力將未處理的或者轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，按照每孔2000個細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h，加入適宜濃度H2O2刺激24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，然后在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。計算各組的細(xì)胞活力，即細(xì)胞活力=A處理組/A樣品對照組×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，經(jīng)過相應(yīng)分組處理后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，1000 r·min-1離心10 min，棄上清，用試劑盒中Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為109個·L-1，然后按照試劑盒說明書操作加入Annexin V-FITC和PI，混勻后避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5ROS水平和SOD含量檢測ROS水平和SOD含量檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平時，先按照11000的比例用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol·L-1。按照109個·L-1的細(xì)胞密度加入稀釋好的DCFH-DA，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次(去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA)，然后使用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm和525 nm。

檢測細(xì)胞內(nèi)SOD含量時，先用移液槍吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，然后加入100 μL SOD樣品制備液裂解細(xì)胞，4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min，取上清液按照試劑盒說明書加入各試劑。最后在450 nm波長處測定A值。

1.2.6總RNA提取和Real-timePCR用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，檢測miR-29a的表達(dá)時使用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit試劑盒將5 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄，按照TaqMan miRNA assay Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)。檢測BMF和BAK1 mRNA的表達(dá)時，用SuperQuick RT MasterMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將 1 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄后，使用Super TaqMan Mixture進(jìn)行Real-time PCR檢測。使用公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達(dá)量，miR-29a以U6為內(nèi)參，BMF和BAK1以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

全省機(jī)構(gòu)改革動員大會后，廳黨組連續(xù)召開專題會議、黨組會議、黨組擴(kuò)大會議、市局局長座談會，深入學(xué)習(xí)習(xí)近平總書記關(guān)于深化黨和國家機(jī)構(gòu)改革的重要論述、關(guān)于生態(tài)文明建設(shè)和自然資源管理的重要論述，傳達(dá)貫徹全省機(jī)構(gòu)改革動員大會精神和省級機(jī)構(gòu)改革人員轉(zhuǎn)隸及部門“三定”工作培訓(xùn)班要求，全面動員部署，扎實有序推進(jìn)，比較圓滿地完成了機(jī)構(gòu)改革階段性任務(wù)。

表1引物序列

基因上游引物下游引物miR-29a5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATCTGAA-3’5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’U65’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’BMF5’-TTCCCTCCTTCCCAATCGAG-3’5’-CCATCTCTCCTGGGTGACTC-3’BAK15’-GATCCCGGCAGGCTGATCC-3’5’-GTAGCTGCGGAAAACCTCCT-3’GAPDH5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’5’-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3’

1.2.7Westernblotting檢測蛋白表達(dá)利用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，4 ℃高速離心15 min，收集上清液即為總蛋白。BCA試劑盒測定所提取的總蛋白濃度，每孔取40 μg總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，然后加入提前稀釋的一抗4 ℃過夜孵育，TBS洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，將ECL發(fā)光液均勻加至膜上，拍照后用ImageJ軟件分析條帶的灰度值，檢測各組BMF和BAK1蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1H2O2濃度的確定CCK-8法檢測不同濃度的H2O2對HLE-B3細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，0 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1H2O2處理組中細(xì)胞活力分別為(99.17±3.76)%、(79.33±6.02)%、(59.67±8.83)%、(31.33±6.41)%和(14.00±6.36)%。HLE-B3細(xì)胞活力隨著H2O2濃度的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)劑量依賴性。后續(xù)實驗中H2O2濃度選擇200 μmol·L-1。

2.2各組miR-29a的表達(dá)200 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細(xì)胞，Real-time PCR檢測細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組中miR-29a的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組相比，H2O2+miR-29a模擬物組中miR-29a的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但H2O2+模擬物對照組中miR-29a的表達(dá)變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組細(xì)胞活力檢測CCK-8法檢測各組中HLE-B3細(xì)胞活力，結(jié)果見表2。與對照組相比，H2O2組中細(xì)胞活力降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組相比，H2O2+miR-29a模擬物組中細(xì)胞活力增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但H2O2+模擬物對照組中細(xì)胞活力變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2各組miR-29a表達(dá)及細(xì)胞活力

組別miR-29a表達(dá)細(xì)胞活力/%對照組1.03±0.0999.17±3.76H2O2組0.56±0.12?59.67±10.09?H2O2+模擬物對照組0.62±0.1254.50±12.86H2O2+miR-29a模擬物組4.49±0.55#92.83±8.09#F值251.4035.70P值0.000.00

注：與對照組相比，*P<0.05；與H2O2組相比，#P<0.05

2.4各組細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡，結(jié)果見圖1。對照組、H2O2組、H2O2+模擬物對照組和H2O2+miR-29a模擬物組中細(xì)胞凋亡率分別為(3.53±1.21)%、(40.30±4.76)%、(42.32±6.35)%和(18.74±2.48)%。與對照組相比，H2O2組中細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2組相比，H2O2+miR-29a模擬物組中細(xì)胞凋亡率顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但H2O2+模擬物對照組中細(xì)胞凋亡率變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5各組ROS水平和SOD含量檢測各組中ROS水平和SOD含量，結(jié)果見表3。與對照組相比，H2O2組中ROS水平升高，SOD含量減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；與H2O2組相比，H2O2+miR-29a模擬物組中ROS水平降低，SOD含量增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，但H2O2+模擬物對照組中兩者變化均不大，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.6各組BMF和BAK1的表達(dá)Real-time PCR和Western blotting檢測各組中BMF和BAK1 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖2和表4。與對照組相比，H2O2組中BMF和BAK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)；與H2O2組相比，H2O2+miR-29a模擬物組中BMF和BAK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，但H2O2+模擬物對照組中兩者mRNA和蛋白表達(dá)變化均不大，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

表3各組ROS水平和SOD含量

組別ROS /%SOD/U·mL-1對照組101.31±7.3790.26±3.98H2O2組299.52±43.95?52.97±6.64?H2O2+模擬物對照組285.25±57.6653.89±10.78H2O2+miR-29a模擬物組143.13±21.32#84.03±6.31#F值41.5042.85P值0.000.00

注：與對照組相比，*P<0.05；與H2O2組相比，#P<0.05

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況

3 討論

圖2 Western blotting檢測BMF和BAK1蛋白表達(dá)。1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+模擬物對照組；4：H2O2+miR-29a模擬物組

miR-29a是近年來廣泛研究的一個mRNA。它在多種生命過程中發(fā)揮重要作用，如成骨分化[8]、血糖調(diào)節(jié)[9]和多種癌癥[10]等。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a在白內(nèi)障大鼠的晶狀體中表達(dá)下調(diào)[7]，但是目前還未見miR-29a在白內(nèi)障中具體作用和機(jī)制的相關(guān)研究。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激后HLE-B3細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)下調(diào)，這與miR-29a在白內(nèi)障大鼠晶狀體中的表達(dá)結(jié)果[7]相一致。

晶狀體上皮細(xì)胞凋亡在白內(nèi)障形成過程中具有重要作用，并且H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激能夠引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[3，11]。本研究我們通過轉(zhuǎn)染miR-29a模擬物在HLE-B3細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a，探究miR-29a對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H2O2組相比，上調(diào)miR-29a表達(dá)增加了HLE-B3細(xì)胞的活力，減少了細(xì)胞凋亡。現(xiàn)普遍認(rèn)為，氧化應(yīng)激是促氧化劑與抗氧化劑之間的一種不平衡狀態(tài)。有研究顯示，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞線粒體損傷會增加ROS水平[12]。SOD是抗氧化防御系統(tǒng)中能夠清除自由基的一種重要酶。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-29a表達(dá)能夠降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平，增加SOD的含量。這些結(jié)果表明， miR-29a能夠減少H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷。

表4各組BMF和BAK1mRNA和蛋白表達(dá)

組別BMFmRNA蛋白BAK1mRNA蛋白對照組1.03±0.100.13±0.051.02±0.080.10±0.06H2O2組2.54±0.18?1.17±0.09?3.49±0.23?0.99±0.15?H2O2+模擬物對照組2.46±0.381.23±0.153.33±0.421.05±0.12H2O2+miR-29a模擬物組1.46±0.20#0.50±0.09#1.60±0.19#0.37±0.08#F值61.0085.28133.0157.17P值0.000.000.000.00

注：與對照組相比，*P<0.05；與H2O2組相比，#P<0.05

BMF是Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白BH3-only家族中的一個促凋亡成員。有研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞失去對其基膜的黏附后，BMF誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。BAK1是Bcl-2家族的一員，它是線粒體凋亡的一個重要調(diào)節(jié)分子[14]。已有研究顯示，在人正常肝細(xì)胞系L02中，H2O2處理能夠上調(diào)BMF的表達(dá)[15]。在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中，H2O2處理能夠增加BAK1的表達(dá)[16]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，H2O2處理HLE-B3細(xì)胞后，BMF和BAK1的表達(dá)均上調(diào)。Xia等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，BMF和BAK1是miR-29a的靶基因。因此，本研究我們進(jìn)一步探究了在H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中miR-29a與BMF和BAK1的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在人晶狀體上皮細(xì)胞中，過表達(dá)miR-29a能夠下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的BMF和BAK1表達(dá)。

綜上，本研究結(jié)果表明，miR-29a能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷，這可能是通過下調(diào)BMF和BAK1的表達(dá)發(fā)揮作用的。隨著研究的深入，miR-29a有望為白內(nèi)障的非手術(shù)治療提供新靶點。