胸腺肽β4對(duì)H2O2誘導(dǎo)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及繼發(fā)細(xì)胞凋亡的抑制作用△

劉菁華 郝朋 李軒

角膜是人體重要的屈光介質(zhì)，由于其位于眼球前部，直接與外部環(huán)境接觸，因此較易遭受外界有害物質(zhì)的侵害。氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化反應(yīng)失衡導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，其中常見(jiàn)的ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥基(·OH)及過(guò)氧化氫(H2O2)等。機(jī)體內(nèi)ROS過(guò)量會(huì)對(duì)DNA、蛋白及脂肪酸造成一定的損傷[1]。有研究證實(shí)，在角膜損傷(如化學(xué)損傷、紫外線照射等)及部分角膜疾病(如干眼癥、大泡性角膜病變等)的角膜組織中可檢測(cè)到氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)記物，且此時(shí)角膜的抗氧化能力減弱[2-4]。說(shuō)明角膜在受到某些損傷及疾病侵害時(shí)發(fā)生了氧化應(yīng)激并刺激角膜組織產(chǎn)生大量的ROS及一氧化氮，導(dǎo)致有毒物質(zhì)增多，最終加劇角膜組織的損傷[5]。因此，緩解及修復(fù)角膜氧化應(yīng)激損傷對(duì)部分角膜病及角膜損傷的治療具有重要意義。

胸腺肽β4(thymosin β4，Tβ4)是胸腺肽家族的一員，在正常人體中的分布最為廣泛。Tβ4作為一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，其主要作用是通過(guò)與肌動(dòng)蛋白結(jié)合來(lái)抑制激動(dòng)蛋白與肌絲的結(jié)合[6]?，F(xiàn)已有大量研究證實(shí)，Tβ4具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、促增殖、抗炎及抗凋亡的作用[7-9]。我們前期研究證實(shí)，Tβ4對(duì)體外培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷及繼發(fā)凋亡具有抑制作用[10]。角膜基質(zhì)層是組成角膜的主要部分，其結(jié)構(gòu)的完整及功能的穩(wěn)定對(duì)維持正常角膜功能至關(guān)重要，目前尚未有研究證實(shí)Tβ4對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及繼發(fā)凋亡有抑制作用。本研究使用體外培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)其發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，在此基礎(chǔ)上探討Tβ4對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及繼發(fā)凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取清潔級(jí)健康成年新西蘭大白兔(天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)5只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，無(wú)眼部外傷及疾病，角膜屈光介質(zhì)透明。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用均遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2主要試劑及儀器主要試劑：Tβ4、DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青鏈霉素混合液(青霉素10×103U·mL-1，鏈霉素10×103μg·mL-1)(美國(guó)Gibco公司)；2.5 g·L-1胰蛋白酶(美國(guó)Biotopped公司)；細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)(日本DOJINDO研究所)；活性氧檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR引物(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶(美國(guó)Promega公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅰ(日本Takara公司)。主要耗材及儀器有：CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；Realplex2熒光定量PCR儀(德國(guó)Eppendorp公司)。

1.2方法

1.2.1兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)采用空氣栓塞法將大白兔處死后迅速摘出眼球。用生理鹽水將眼球表面的血污及動(dòng)物毛發(fā)仔細(xì)沖洗干凈，之后將眼周組織剪去。顯微鏡下用眼科剪沿角鞏膜緣內(nèi)1 mm處剪下角膜，并使用含青鏈霉素混合液的PBS沖洗數(shù)次，浸泡15 min，后續(xù)操作嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則。將浸泡后的角膜組織轉(zhuǎn)移至體視顯微鏡下，使用無(wú)菌手術(shù)刀片將角膜上皮及內(nèi)皮刮除干凈，把剩余的角膜基質(zhì)組織切成2 mm×2 mm的小塊并轉(zhuǎn)移至預(yù)先用FBS處理的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。30 min后組織塊底部與培養(yǎng)瓶貼緊，加入含F(xiàn)BS、青鏈霉素混合液及泰樂(lè)菌素的DMEM/F-12培養(yǎng)液放入CO2培養(yǎng)箱(體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃)中培養(yǎng)。見(jiàn)有細(xì)胞從組織塊周邊遷出時(shí)，可將組織塊移出并更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%的細(xì)胞單層融合時(shí)，即可用胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞分為以下3組：正常組、H2O2組、治療組。選取傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F-12培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞過(guò)夜。為建立兔角膜基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，H2O2組細(xì)胞用200 μmol·L-1的H2O2處理4 h，隨后更換為不含F(xiàn)BS的DMEM/F-12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。治療組細(xì)胞則是在H2O2處理后換用含終濃度為1 μg·mL-1Tβ4的無(wú)FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時(shí)把按常規(guī)方法培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞設(shè)立為正常組。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性。將兔角膜基質(zhì)細(xì)胞按10×106個(gè)·L-1的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。24 h后細(xì)胞貼壁并基本單層融合，饑餓處理后分別處理各組細(xì)胞并再加設(shè)一空白組(空白組孔中不接種細(xì)胞，只有不含F(xiàn)BS的DMEM/F-12培養(yǎng)液)。按分組條件處理細(xì)胞后，棄培養(yǎng)液并向孔中加入CCK-8溶液(每孔100 μL)，培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處讀各孔吸光度(A490)值。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(正常組A值-空白組A值)×100%，每個(gè)分組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.42’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針檢測(cè)細(xì)胞ROS水平應(yīng)用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針檢測(cè)各組細(xì)胞的ROS水平。以100×106個(gè)·L-1的濃度接種兔角膜基質(zhì)細(xì)胞到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁并基本單層融合。饑餓處理后按分組條件分別處理各組細(xì)胞。用不含F(xiàn)BS的DMEM/F-12培養(yǎng)基按11000比例稀釋2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(稀釋至10 μmol·L-1)制得探針稀釋工作液。各組細(xì)胞按分組條件處理后，棄掉原培養(yǎng)液并向每孔加800 μL探針稀釋工作液，將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min。PBS洗滌細(xì)胞3次，將多余的探針洗去。顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光著染細(xì)胞數(shù)(488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng))。各組細(xì)胞ROS水平=視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。每孔取3個(gè)視野，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)需檢測(cè)的目標(biāo)基因序列合成擴(kuò)增所需引物(見(jiàn)表1)。按500×106個(gè)·L-1的密度接種角膜基質(zhì)細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁且基本單層融合。饑餓處理后根據(jù)分組條件分別處理各組細(xì)胞。按總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并于-20 ℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green 10.0 μL、無(wú)菌去離子水8.0 μL、10.0 μmol·L-1的上下游引物各0.5 μL 及cDNA 1.0 μL。按以上體系使用熒光定量PCR儀將各組cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用兩步法，以GAPDH作為內(nèi)參基因，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)步驟為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，62 ℃退火延伸45 s，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析條件為：95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min，95 ℃反應(yīng)15 s，最后4 ℃冷卻降溫。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)3次。

表1相關(guān)引物序列

引物名稱上游引物序列下游引物序列GAPDH5’-CCACTTTGTGAAGCTCATTTCCT-3’5’-TCGTCCTCCTCTGGTGCTCT-3’過(guò)氧化氫酶5’-CTGTTCATCCAGAAGAAAGC-3’5’-CTGCACAAACGTGTGAATCG-3’錳超氧化物歧化酶5’-TATTCCACTGCTGGGGATTG-3’5’-ACATTCTCCCAGGTGATCAC-3’

1.2.6TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率采用TUNEL染色檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平。按100×106個(gè)·L-1在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁并基本單層融合。饑餓處理后按分組條件分別處理各組細(xì)胞。室溫條件下用40 g·L-1多聚甲醛固定細(xì)胞1 h，含體積分?jǐn)?shù)3%H2O2的甲醇封閉細(xì)胞20 min，在2～8 ℃條件下含體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X-100的1 g·L-1檸檬酸鈉通透細(xì)胞3 min。按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制TUNEL工作液并加入孔中，37 ℃條件下暗室加濕反應(yīng)1 h。PBS洗凈多余TUNEL工作液，觀察前用10 μg·mL-1DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色著染的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。細(xì)胞凋亡率=視野中陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野中細(xì)胞總數(shù)×100%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔選取3個(gè)視野，重復(fù)3次。

1.2.7ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)將兔角膜基質(zhì)細(xì)胞按500×106個(gè)·L-1的濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后細(xì)胞貼壁且基本單層融合。饑餓處理后按分組條件分別處理細(xì)胞。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，按說(shuō)明書(shū)要求制備細(xì)胞提取液，將細(xì)胞提取液、濃度梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)抗體藥品加入包被了抗體的檢測(cè)板中，孵育后使用酶標(biāo)儀450 nm讀值(A450)，570 nm下讀校準(zhǔn)值(A570)。將各組校準(zhǔn)后A值(A450-A570)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到各組Caspase-3的質(zhì)量濃度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)至第3天時(shí)，可見(jiàn)組織塊周邊有角膜基質(zhì)細(xì)胞遷出，貼壁并逐漸延伸生長(zhǎng)。移出組織塊繼續(xù)培養(yǎng)至7 d時(shí)，可見(jiàn)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞呈多角形。細(xì)胞呈單層融合時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，規(guī)則排列呈束狀。

2.2各組細(xì)胞活性比較正常組細(xì)胞活性為(100.00±0.00)%、H2O2組(66.41±9.28)%、治療組(82.54±7.72)%，3組間細(xì)胞活性總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.260，P<0.01)。組間兩兩比較，H2O2組細(xì)胞活性明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組細(xì)胞活性明顯高于H2O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3各組氧化應(yīng)激損傷情況分析結(jié)果

2.3.1各組細(xì)胞活性氧水平熒光顯微鏡下觀察到各組細(xì)胞著染情況(圖1)，經(jīng)計(jì)算得正常組細(xì)胞ROS水平為(4.12±0.93)%、H2O2組(77.84±6.98)%、治療組(59.48±8.92)%。與正常組相比，H2O2組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的強(qiáng)陽(yáng)性著染。采用行×列χ2檢驗(yàn)對(duì)3組細(xì)胞活性氧水平進(jìn)行總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩兩比較結(jié)果顯示，H2O2組細(xì)胞的ROS水平明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組細(xì)胞的ROS水平明顯低于H2O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞著染情況(×10)。A：正常組；B：H2O2組；C：治療組

2.3.2各組細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量三組細(xì)胞過(guò)氧化氫酶及錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.918，P=0.001；F=11.975，P<0.01)。H2O2組細(xì)胞過(guò)氧化氫酶及錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；治療組細(xì)胞過(guò)氧化氫酶及錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量較H2O2組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組細(xì)胞凋亡情況分析結(jié)果

2.4.1各組細(xì)胞凋亡率正常組細(xì)胞凋亡率為(6.81±1.48)%、H2O2組(76.14±6.12)%、治療組(39.04±7.47)%；經(jīng)行×列χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示3組細(xì)胞凋亡率總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組細(xì)胞凋亡率明顯低于H2O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

表2各組細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量

組別n過(guò)氧化氫酶 mRNA錳超氧化物歧化酶 mRNA正常組31.00±0.001.00±0.00H2O2組30.59±0.37?0.64±0.28?治療組32.16±1.37#2.06±1.07#F值8.91811.975P值<0.01<0.01

注：與正常組比較，*P<0.05；與H2O2組比較，#P<0.05

2.4.2各組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的含量正常組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的質(zhì)量濃度為(0.46±0.09)ng·mL-1、H2O2組(0.95±0.08)ng·mL-1、治療組(0.56±0.17)ng·mL-1。3組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的質(zhì)量濃度總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.932，P<0.01)。組間兩兩比較結(jié)果顯示，H2O2組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的質(zhì)量濃度較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的質(zhì)量濃度明顯低于H2O2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞凋亡水平(×10)

3 討論

角膜是人體最重要的屈光元件之一，可分為五層，其中角膜基質(zhì)層主要由膠原纖維及角膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，其厚度占整個(gè)角膜的90%，故角膜基質(zhì)的透明度及正常結(jié)構(gòu)直接影響到角膜的屈光視覺(jué)功能[11]。氧化反應(yīng)是一種基本的生化反應(yīng)，在正常機(jī)體衰老的過(guò)程中不可避免，在損傷或疾病的情況下機(jī)體局部氧化及抗氧化的平衡被打破，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)量ROS會(huì)對(duì)局部組織造成損傷。本研究中，H2O2組細(xì)胞活力較正常組顯著下降，說(shuō)明一定濃度的H2O2對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞造成了一定的損傷，與此同時(shí)，我們應(yīng)用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞相比，H2O2組兔角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高。因此說(shuō)明兔角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)一定濃度H2O2誘導(dǎo)后發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)并對(duì)細(xì)胞造成損傷。

Tβ4因其促進(jìn)傷口愈合、抗炎及抗凋亡的作用而成為治療很多疾病的新選擇。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組兔角膜基質(zhì)細(xì)胞在加入一定濃度的Tβ4之后，細(xì)胞活性較H2O2組有顯著提高，且其ROS水平與H2O2組相比較也有了顯著的下降，證明Tβ4能有效清除細(xì)胞內(nèi)因氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS，于是我們對(duì)其清除ROS的可能機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探討。正常角膜基質(zhì)層功能的維持與角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)外環(huán)境中分泌的相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子有關(guān)。過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶為機(jī)體內(nèi)主要的過(guò)氧化物酶，可以分解過(guò)氧化物從而達(dá)到抗氧化的作用。有研究證實(shí)，在人角膜上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中，過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量下降，而Tβ4可上調(diào)二者的表達(dá)[12]。我們?cè)谕媒悄せ|(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中也檢測(cè)了過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示H2O2組細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組均顯著下降，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)氧化及抗氧化的平衡被打破且無(wú)法代償，而在Tβ4治療組細(xì)胞中，過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量較H2O2組升高，提示在兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型中，Tβ4亦可上調(diào)過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶的表達(dá)，從而幫助機(jī)體加快清除過(guò)氧化物以減輕損傷。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)TUNEL染色后，H2O2組細(xì)胞凋亡率較其他組顯著增高，說(shuō)明H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)使細(xì)胞繼發(fā)凋亡。經(jīng)Tβ4處理后，治療組細(xì)胞凋亡率顯著下降，證實(shí)了Tβ4的抗凋亡作用。目前大量研究表明Caspase-3蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是一種促凋亡因子[13-14]。為探討Tβ4在角膜基質(zhì)細(xì)胞中的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了各組細(xì)胞中Caspase-3的蛋白濃度，結(jié)果顯示與正常組相比，H2O2組的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞Caspase-3蛋白的質(zhì)量濃度明顯升高，而治療組細(xì)胞的Caspase-3蛋白質(zhì)量濃度與H2O2組相比顯著下降，該結(jié)果與TUNEL染色的結(jié)果相符。說(shuō)明H2O2組細(xì)胞因Caspase-3蛋白的表達(dá)上調(diào)造成細(xì)胞凋亡，而Tβ4可有效下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，經(jīng)一定濃度H2O2處理后可使體外培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并進(jìn)一步繼發(fā)細(xì)胞凋亡。Tβ4可有效減輕兔角膜基質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷并抑制細(xì)胞凋亡，該作用與Tβ4對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)，但調(diào)節(jié)涉及的具體通路還需進(jìn)一步研究。