心臟發(fā)育過(guò)程中的分子調(diào)控

吳 錚 許棟明 孫芳玲 劉婷婷 郭德玉 艾厚喜 王 文

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)引起死亡的十大疾病中，缺血性心臟病位居第2位，并呈逐年上升的趨勢(shì)。而目前已知的是，心肌梗死的病理機(jī)制是由于嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化堵塞冠狀動(dòng)脈管腔，而導(dǎo)致心肌細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于缺血、缺氧狀態(tài)下而引起細(xì)胞壞死，而缺血壞死的心肌細(xì)胞會(huì)引起心臟重構(gòu)等結(jié)構(gòu)變化，最終患者因不可逆的心肌梗死而引起心力衰竭導(dǎo)致死亡。但目前已知的治療心肌梗死的方法很有限，基本上是急性心肌梗死后引起患者出現(xiàn)癥狀后的介入治療，或口服藥物預(yù)防心肌梗死的發(fā)生；而傳統(tǒng)的藥物治療是針對(duì)左心室功能紊亂的機(jī)制來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并不能夠徹底解決心肌細(xì)胞壞死的根本問(wèn)題[1]。

目前，人類心肌組織的再生仍然是作為治療心血管疾病主要的研究目標(biāo)。人們?cè)欢日J(rèn)為成熟的心肌細(xì)胞不具備再生的能力，但是近些年研究發(fā)現(xiàn)一些魚(yú)類和兩棲動(dòng)物可以在心肌受損后自行再生，新生鼠在出生后1周內(nèi)也有這種再生修復(fù)能力[2，3]。也發(fā)現(xiàn)成年鼠在心肌梗死后也有少量的心肌細(xì)胞出現(xiàn)再生現(xiàn)象，雖然過(guò)程緩慢并不能夠完全彌補(bǔ)心肌梗死后大量心肌細(xì)胞的丟失。經(jīng)cre-loxp方法追蹤發(fā)現(xiàn)，這些少量再生的心肌細(xì)胞可能來(lái)自于祖細(xì)胞池。為了能夠證實(shí)發(fā)生心肌梗死后的心臟可能會(huì)激發(fā)內(nèi)源性心臟祖細(xì)胞分化成新的心肌細(xì)胞，關(guān)鍵是要更深入了解心肌細(xì)胞從胚胎分化和增殖的分子機(jī)制。本文主要將在心臟發(fā)育過(guò)程中一些相關(guān)分子的調(diào)控作用進(jìn)行綜述，以及為研究心臟受損后的心肌細(xì)胞再生提供一定的理論基礎(chǔ)。

一、心臟的發(fā)育過(guò)程

小鼠心臟發(fā)育開(kāi)始于胚胎發(fā)育第7.5天，這個(gè)時(shí)期(即原腸胚時(shí)期)胚胎有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層3個(gè)胚層，心臟組織大部分是從中胚層發(fā)育而來(lái)。由于胚胎的折疊作用導(dǎo)致生心區(qū)形成，第一生心區(qū)的心臟祖細(xì)胞增殖逐漸發(fā)育成線性心管。隨著心臟發(fā)育進(jìn)行，心管的頭端逐漸與動(dòng)脈極相連，尾端與靜脈極相連，到胚胎第9天整個(gè)心管開(kāi)始發(fā)生彎曲。在彎曲的過(guò)程中，心管各段的細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同，導(dǎo)致心管膨大出心球、心室、心房和靜脈竇4部分，同時(shí)開(kāi)始從靜脈極向動(dòng)脈極泵血。緊接著房室在食管的壓制下，逐漸擴(kuò)大形成原始的左心室和右心室。幾乎在胚胎第11.5天之后心肌細(xì)胞大量增殖，心臟內(nèi)部開(kāi)始分隔，逐漸形成4個(gè)腔室，心室壁在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)心肌小梁，隨著心肌細(xì)胞增殖又逐漸消失直至出生[4]。

另外，脊椎動(dòng)物心臟表面還覆蓋著與心肌細(xì)胞不同的一類組織：心外膜。心外膜不是一群簡(jiǎn)單的同源細(xì)胞，在心臟發(fā)育過(guò)程的重要性常被忽視。人們一度認(rèn)為心外膜是心包的一部分，起源于心肌細(xì)胞，直到19世紀(jì)60年代才對(duì)其有所發(fā)現(xiàn)并更正此觀念。小鼠胚胎第8.5天，前心外膜(proepicardium，PE)坐落在近靜脈竇的位置，接著遷移至心臟表面，附著后增殖，形成一層外膜結(jié)構(gòu)包裹心臟[5]。心外膜雖與心肌細(xì)胞同時(shí)來(lái)自中胚層的分化，但是心外膜細(xì)胞本身具有分化能力，它可分化成平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞，而心外膜細(xì)胞的分化能力可能會(huì)成為心肌梗死后心臟有能力再生的關(guān)鍵性線索[6]。

二、心臟發(fā)育過(guò)程中的分子調(diào)控

1.生心區(qū)形成的分子調(diào)控：心臟發(fā)育的第一步是原條細(xì)胞的T-box轉(zhuǎn)錄因子Eomesodermin(Eomes)激活BHLH轉(zhuǎn)錄因子——心臟特化起始標(biāo)志物Mesoderm Posterior 1(Mesp1)，而這些原條細(xì)胞融合在中線靠近前腸的位置并形成生心區(qū)[7]。Mesp1可以通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)中的因子FGFs、VEGFs和PDGFs激活Mesp1-RasGRP-ERK信號(hào)，以調(diào)節(jié)心臟前體細(xì)胞的遷移[8]。在心臟特化過(guò)程中Mesp1的調(diào)節(jié)是多面性的，既可促進(jìn)心臟特化又可保持細(xì)胞多潛能性。心臟前體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生心區(qū)后，下調(diào)Mesp1和其家族的Mesp2激活轉(zhuǎn)錄因子來(lái)促使心臟進(jìn)行分化。

心臟發(fā)育過(guò)程中還有一些信號(hào)通路決定了生心區(qū)的形成，包括來(lái)自前腸內(nèi)胚層的促生心信號(hào)和來(lái)自中線以及神經(jīng)板的抗生心信號(hào)，這些因子決定生心區(qū)大小以及形狀。促生心因子有Hedgehog、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)和非經(jīng)典Wnt/JNK通路[9]；抗生心因子有經(jīng)典Wnt信號(hào)通路、脊索分泌的BMP拮抗劑Noggin和Chordi[4]。

2.第一生心區(qū)和第二生心區(qū)的發(fā)育的分子調(diào)控：生心區(qū)包括第一生心區(qū)和第二生心區(qū)，最早表達(dá)Mesp1的前體細(xì)胞構(gòu)成第一生心區(qū)(first heart field，F(xiàn)HF)——最初的生心區(qū)，而來(lái)自咽喉中胚層的Mesp1陽(yáng)性前體細(xì)胞構(gòu)成第二生心區(qū)(second heart field，SHF)[10]。相對(duì)FHF而言SHF的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，但分化卻相對(duì)緩慢。FHF已經(jīng)開(kāi)始增殖分化并逐漸形成心管；而SHF仍處于未分化祖細(xì)胞的狀態(tài)。隨著心管的發(fā)育，靜脈極和動(dòng)脈極逐漸形成，SHF的多功能祖細(xì)胞才遷移至靜脈極和動(dòng)脈極參與心臟的發(fā)育。鼠的胚胎中FHF細(xì)胞主要分化構(gòu)成左心室和心房的一部分， SHF細(xì)胞分化構(gòu)成右心室、心房，流入道和流出道[11]。

FHF和SHF細(xì)胞表達(dá)的基因決定了其分化的早晚。FHF細(xì)胞表達(dá)Tbx5及HCN4和Nkx2.5[12, 13]。SHF細(xì)胞特異性的表達(dá)LIM同源轉(zhuǎn)錄因子Islet1和轉(zhuǎn)錄因子Tbx1，以及生長(zhǎng)因子Fgf8和Fgf10。

經(jīng)典Wnt /β-catenin激活鼠胚胎中SHF細(xì)胞的Islet1表達(dá)，同時(shí)保持Islet1陽(yáng)性祖細(xì)胞分化潛能的穩(wěn)態(tài)[14]。Islet1調(diào)節(jié)咽喉內(nèi)胚層表達(dá)Shh，促進(jìn)SHF細(xì)胞增殖。Shh也是SHF發(fā)育過(guò)程中很重要的分子，研究發(fā)現(xiàn)敲除Shh表達(dá)后會(huì)引起SHF細(xì)胞的缺失，最終導(dǎo)致右心室和流出道發(fā)育不全[15]。Shh促使Tbx1激活Fgf3、Fgf8和Fgf10，而Fgf8可以促進(jìn)SHF發(fā)育，消融Fgf8心臟無(wú)法形成右心室或者流出道[16]。

3.心腔形成的分子調(diào)控：形成線性心管的心肌細(xì)胞被稱作初級(jí)心肌，它們有增殖速度慢、自律性有限、傳導(dǎo)性以及收縮性差的特性[17]。在心臟形成內(nèi)部結(jié)構(gòu)的初期，初級(jí)心肌未表現(xiàn)出增殖的形態(tài)，但是心管開(kāi)始向外部擴(kuò)張之后，初級(jí)心肌細(xì)胞就開(kāi)始增殖分化并形成心房和心室的細(xì)胞。心管的蠕動(dòng)可促使心臟形成的進(jìn)程，同時(shí)心內(nèi)膜和心肌細(xì)胞也根據(jù)血流動(dòng)力的驅(qū)使以及心臟收縮方式改變著它們細(xì)胞的形態(tài)并且影響細(xì)胞增殖的速度，最終心房以及心室細(xì)胞構(gòu)成腔室的結(jié)構(gòu)，也具有了其細(xì)胞的特性，包括細(xì)胞的興奮性、自律性、傳導(dǎo)性和收縮性。

參與調(diào)節(jié)心腔形成的因子包括T-box的轉(zhuǎn)錄因子Tbx2、Tbx3、Tbx5、Tbx20以及Nkx2.5、Gata4、Cited1、Irx4、Irx1/Irx3/Irx5和Hand1[11]。各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在不同心肌細(xì)胞中表達(dá)不一。其中，T-box的表達(dá)模式比較狹窄，相比較Nkx2.5和Gata4表達(dá)在整個(gè)心管中，Tbx5只在流入道和初級(jí)心房中有較高的表達(dá)，在初級(jí)心室中表達(dá)相對(duì)較少，而在流出道中不表達(dá)；Tbx2和Tbx3相比較Tbx2表達(dá)量更大，它們?cè)诹鞒龅?、?nèi)部的結(jié)構(gòu)、房室的管道和流入道的初級(jí)心肌中均有表達(dá)；而Tbx20在心管中廣泛表達(dá)[18，19]。Tbx5和Tbx20能夠結(jié)合Nkx2.5及Gata4通過(guò)誘導(dǎo)心房利鈉肽因子Nppa、連接蛋白connexin40和connexin43以及細(xì)胞骨架蛋白Chisel，促進(jìn)心腔心肌細(xì)胞表達(dá)特異化[20]。Tbx5與Nkx2.5結(jié)合還可通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制因子Id2的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)左右心室肌束結(jié)構(gòu)的形成[21]。與Tbx5和Tbx20不同，Tbx2和Tbx3也可以與 Nkx2.5和Gata4相互作用，達(dá)到抑制心腔增殖和特異性分化的作用，最終影響心腔的形成[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在小鼠體內(nèi)對(duì)Tbx2過(guò)表達(dá)會(huì)可導(dǎo)致Tbx20表達(dá)的缺失，進(jìn)而影響了心腔的發(fā)育[19]。轉(zhuǎn)錄因子Tbx3主要的功能是通過(guò)抑制竇房連接部位的細(xì)胞表達(dá)HCN4，而影響心臟竇房結(jié)的形成[21]。

心臟發(fā)育過(guò)程中形成的4個(gè)腔室，每個(gè)腔室的心肌表達(dá)基因并不完全相同。在小鼠的心房中通常表達(dá)MLC2a，而在心室中則表達(dá)MLC2v，其中左心室表達(dá)eHAND，右心室中表達(dá)dHAND[11]。在心房發(fā)育時(shí)，左心房高表達(dá)Pitx2，會(huì)抑制Shox2，導(dǎo)致竇房結(jié)發(fā)育受抑制進(jìn)而阻止了異位起搏點(diǎn)的分化[22]。而在雞發(fā)育過(guò)程中，兩個(gè)腔室均表達(dá)Irx4，它是通過(guò)激活心室肌球蛋白MHC1而達(dá)到抑制心房表達(dá)MHC197，雞胚中右心室表達(dá)Tbx20，而左心室不表達(dá)Tbx20[23]。

4.心室心肌小梁發(fā)育的分子調(diào)控：在左右腔室形成后心肌細(xì)胞開(kāi)始明顯增殖，結(jié)果分隔形成4個(gè)腔室，室壁擴(kuò)增直至最后完成心臟的發(fā)育。在這個(gè)過(guò)程中心肌細(xì)胞從心外膜下層增殖形成一個(gè)收縮束樣的網(wǎng)狀組織，稱為網(wǎng)狀心肌小梁。心肌小梁細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上與內(nèi)皮組織類似，心肌小梁多見(jiàn)于心室而少見(jiàn)于心房，并在冠狀血管發(fā)育前為心臟提供能量和氧氣。緊接著，心外膜下層心肌細(xì)胞增殖快于內(nèi)層心肌細(xì)胞并呈現(xiàn)一種更小更致密的形態(tài)，這個(gè)過(guò)程稱為心室致密化，心室致密化一直持續(xù)到出生。在此期間，冠狀血管結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)育，心肌增殖能力逐漸減弱，在出生時(shí)致密的心肌幾乎包含整個(gè)左心室。

穿膜受體Notch1是心內(nèi)膜與心肌相互調(diào)節(jié)最主要的受體，當(dāng)心內(nèi)膜細(xì)胞外的Notch結(jié)合Delta4和Jagged之后，其在心內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)的部分(notch intracellular domain，NICD)會(huì)斷裂開(kāi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄抑制因子RBPJK結(jié)合，并上調(diào)BMP10達(dá)到激活細(xì)胞增殖的作用。在沉默rbpjk的小鼠心內(nèi)膜中的EphrinB2和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin1，NRG1)表達(dá)量均下降，小梁發(fā)育時(shí)NICD1激活EphrinB2，而EphrinB2可促進(jìn)NRG1表達(dá)，從而介導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖[24]。NRG1是心內(nèi)膜生長(zhǎng)因子，與酪氨酸蛋白激酶受體ErbB4結(jié)合后和ErbB2形成二聚體，激活信號(hào)傳遞介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移[25]。沉默Tbx20的小鼠不能夠形成小梁，并會(huì)在胚胎發(fā)育10.5天死去，說(shuō)明Tbx20主要的作用是促進(jìn)心肌細(xì)胞分裂和小梁的形成而不是心臟祖細(xì)胞前期的分化[4]。

在心管形成后，心內(nèi)膜和心肌層之間形成一層很厚的細(xì)胞外基質(zhì)，稱為心膠質(zhì)，心膠質(zhì)對(duì)心肌小梁的增殖和心臟發(fā)育起到關(guān)鍵的作用。室間隔形成時(shí)心內(nèi)膜和心肌的Has-1編碼生成透明質(zhì)酸，Vcan編碼生成多功能蛋白聚糖versican，小鼠體內(nèi)如果缺少這兩者則不能生成小梁，也會(huì)導(dǎo)致室間隔缺失[26]。整合素樣金屬蛋白酶與凝血酶Ⅰ型結(jié)合蛋白(ADAMTS1)和共作用因子Fibulin-1能裂解versican影響心膠質(zhì)的降解，心膠質(zhì)降解的同時(shí)小梁增殖逐漸衰退；缺少Fibulin-1的小鼠ADAMTS1活性減弱，導(dǎo)致小梁過(guò)增殖同時(shí)心室致密化不能進(jìn)行[27]。此外， Integrin β1與Integrinα可以形成異質(zhì)二聚體，之后與成纖維細(xì)胞的纖連蛋白和膠原結(jié)合，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，其中成纖維細(xì)胞主要分布在致密部分； Integrin β1沉默的心肌細(xì)胞在致密化過(guò)程中的心肌細(xì)胞增殖速率明顯下降[28]。

三、心外膜發(fā)育的分子調(diào)控

小鼠的心外膜來(lái)自前心外膜細(xì)胞，PE最開(kāi)始是菜花樣體腔細(xì)胞簇，它們向著心包腔指狀突出，隨著發(fā)育進(jìn)行這些細(xì)胞聚集在心臟流入道后方，覆蓋橫隔。當(dāng)PE接觸到心肌層，它們開(kāi)始平鋪伸展成鵝卵石樣單層上皮，逐漸長(zhǎng)滿整個(gè)心臟形成固定空間結(jié)構(gòu)，即為初級(jí)心外膜。

Fgf8/Snai1可以調(diào)節(jié)前心外膜細(xì)胞最原始的發(fā)育，F(xiàn)gfs能夠促進(jìn)PE增殖同時(shí)保證PE不分化成心肌細(xì)胞。BMP2的低表達(dá)也能夠維持PE的特性通過(guò)促進(jìn)Tbx18和Wilms腫瘤抑制蛋白(wilms tumor suppressor protein，Wt1)表達(dá)，然而高表達(dá)BMP2則誘導(dǎo)PE向心肌分化，抑制BMP信號(hào)能降低PE標(biāo)志物Tbx18和Tcf21的表達(dá)。研究小鼠胚胎發(fā)現(xiàn)Integrinα4和血管黏附分子1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)可穩(wěn)定心外膜黏附于心肌層，并且使心外膜細(xì)胞在心臟表面遷移，靶向使VCAM-1或者Integrin 4失活會(huì)損壞心外膜和冠狀動(dòng)脈的形成。

在PE形成初級(jí)心外膜后，一些心外膜上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)后侵入到心肌層，為發(fā)育中的胚胎結(jié)構(gòu)提供間質(zhì)細(xì)胞。Wt1是這一過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，最早在小鼠胚胎9.5天的PE中表達(dá)，隨著發(fā)育的進(jìn)行，Wt1開(kāi)始表達(dá)于室間隔、左心室和右心室中，并且表達(dá)于心外膜的衍生細(xì)胞包括纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中，但是否表達(dá)于心肌細(xì)胞和心內(nèi)膜細(xì)胞中目前還存在爭(zhēng)議。Notch1信號(hào)通路在這一過(guò)程中促進(jìn)血管祖細(xì)胞穿過(guò)致密的心肌細(xì)胞，這些細(xì)胞可以分化成心臟成纖維細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是EMT中重要調(diào)控因子，Wt1促進(jìn)β-catenin和Lef1在心外膜中表達(dá)；相反，β-catenin缺失也會(huì)導(dǎo)致Wt1缺失，最終導(dǎo)致冠脈發(fā)育不全以及EMT不可進(jìn)行。而維甲酸也調(diào)控著心臟發(fā)育及形態(tài)變化，并在Wt1缺失的心外膜細(xì)胞中Raldh2的表達(dá)降低，維甲酸合成也減少[6]。

目前也有一些研究發(fā)現(xiàn)心外膜細(xì)胞對(duì)于心肌梗死有一定的修復(fù)作用，如心外膜過(guò)表達(dá)Fstl1蛋白可以刺激細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，改善心肌梗死后心臟功能。在心肌梗死前注入胸腺素β4可以使部分成年鼠的祖細(xì)胞表達(dá)Wt1，使其具有成血管潛能；IGF1R可以調(diào)節(jié)心梗后Wt1細(xì)胞的EMT。然而目前人們對(duì)這些問(wèn)題還有爭(zhēng)議，還需要進(jìn)一步的研究探討。

四、展 望

心臟發(fā)育是胚胎發(fā)育中很重要的一個(gè)階段，其中的發(fā)育機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，正逐步地被人們所探究發(fā)現(xiàn)。本文通過(guò)對(duì)心臟發(fā)育中大致的進(jìn)程總結(jié)了相關(guān)分子的調(diào)控機(jī)制，希望可以對(duì)探索治療缺血性心臟病提供一定的啟示作用。因?yàn)槿毖孕呐K病嚴(yán)重危及患者生命，目前對(duì)于心肌細(xì)胞能否再生成為研究的重點(diǎn)。雖然目前體外細(xì)胞移植可以改善心臟功能，但收效有限，且沒(méi)有從根本上解決心肌受損這一問(wèn)題，而且將其真正全面應(yīng)用到心肌梗死的治療還需要進(jìn)一步的改進(jìn)。然而，還有一些問(wèn)題目前還未得到證實(shí)，如心外膜細(xì)胞能否在心肌梗死發(fā)生后發(fā)揮其轉(zhuǎn)化作用，從而使其可轉(zhuǎn)化生成新的心肌細(xì)胞；還有心肌梗死后內(nèi)源性祖細(xì)胞的變化能否通過(guò)信號(hào)通路中的分子過(guò)表達(dá)或沉默而生成新的心肌細(xì)胞，這些都可能會(huì)為缺血性心臟病的治療提供一些可能性。