血清雌三醇的檢測技術(shù)及臨床應(yīng)用

彭絮，鄒迎曙，王軍（通信作者）

北京市醫(yī)療器械檢驗所 （北京 101111）

血清雌三醇（estriol，E3）是由人類胎盤產(chǎn)生的一種甾體雌激素，屬于雌酮和雌二醇的代謝產(chǎn)物[1]。近年來的研究表明，母體血清中雌三醇的水平與胎盤存在密切關(guān)系，可以有效監(jiān)測胎盤功能與胎兒發(fā)育情況[2]。孕婦血清中雌三醇的水平與唐氏綜合征、妊娠高血壓綜合征等均有著密切關(guān)系，快速準(zhǔn)確地檢測血清雌三醇有重要的臨床參考價值。

血清雌三醇的檢測可為臨床干預(yù)提供可靠依據(jù)，但由于激素類物質(zhì)在血液中含量極低，濃度為pmol水平，是臨床實驗室檢測的難題。樣本的前處理方式，檢測儀器的準(zhǔn)確度及精密度，自動化流程等問題都限制了其在臨床應(yīng)用方面的發(fā)展?，F(xiàn)介紹目前臨床實驗室血清雌三醇的各種檢測技術(shù)及相應(yīng)的臨床應(yīng)用。

1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用酶標(biāo)記的抗原分子抗體分子反應(yīng)，使游離的雜蛋白與結(jié)合在固相載體上的目的蛋白分離，并利用產(chǎn)物的顏色深淺來定性或定量的一種分析檢測方法。ELISA屬于競爭性固相酶免疫檢測法，該方法在臨床上已被廣泛應(yīng)用，但由于方法本身存在的缺陷以及操作過程對試驗的檢測結(jié)果影響較大，都會造成試驗性誤診、漏診的發(fā)生[3]。試劑的質(zhì)量，檢測的標(biāo)本，操作技術(shù)，內(nèi)源性物質(zhì)均會影響ELISA檢測的準(zhǔn)確度。喬娜等[4]通過采用ELISA檢測1 912例孕婦早期血清未結(jié)合雌三醇水平等相關(guān)指標(biāo)，繪制受試者的工作特征曲線評價雌三醇單個指標(biāo)與聯(lián)合指標(biāo)以預(yù)測孕期子癇前期的價值，結(jié)果顯示，孕中期子癇前期組血清未結(jié)合雌三醇水平低于正常組（P＜0.05），孕中期輕度子癇前期組血清未結(jié)合雌三醇水平與重度子癇前期組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。子癇前期是妊娠期的特發(fā)疾病，未結(jié)合雌三醇水平對子癇前期有一定的預(yù)測價值。

2 放射免疫測定法

放射免疫測定法（radioimmunoassav，RIA）是將免疫反應(yīng)與放射性核素測量相結(jié)合，根據(jù)射線的多少定性或定量的一種檢測方法，也稱為競爭性飽和分析法。吳丹凝等[5]在傳統(tǒng)的RIA基礎(chǔ)上，以磁微粒為二抗分離劑建立了兩種測定血清雌三醇的分析方法，結(jié)果表明，測定血清雌三醇線性范圍為0.3～30.0 μg/L，批內(nèi)與批間相對偏差最大為4.4%和8.7%，兩種方法反應(yīng)時間短，靈敏度好，其精密度與準(zhǔn)確度均滿足臨床試驗的要求。洪建琴等[6]用RIA測定679例妊娠中晚期孕婦血清雌三醇和甘氨膽酸，發(fā)現(xiàn)正常妊娠孕婦血清雌三醇隨孕周增加而增加，而異常妊娠孕婦在孕32周后雌三醇會明顯降低，過期妊娠孕婦在孕40周前雌三醇在正常孕周下限，40周后會明顯下降，而血清雌三醇會隨著妊娠高血壓癥狀越嚴(yán)重下降程度越快?？傊?，RIA簡便易行，血樣本用量少，但會用到放射性物質(zhì)，且有時會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。

3 時間分辨熒光免疫分析法

時間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是用時間分辨技術(shù)測量熒光的一種非放射性的微量分析檢測方法，TRFIA將非特異性熒光干擾有效地排除，從而可提高檢測結(jié)果的靈敏度，已成為臨床常用的分析檢測方法之一，逐漸代替了RIA。汪國慶等[7]利用TRFIA發(fā)現(xiàn)游離雌三醇的測定結(jié)果由于乳糜樣外觀脂血的程度（輕度、中度與高度脂血）不同而不同，對TRFIA測定血清游離雌三醇存在不同的干擾，從而影響唐氏篩查結(jié)果的準(zhǔn)確度。因此，在臨床唐氏綜合征產(chǎn)前篩查前，應(yīng)采集孕婦空腹血清。孫茜等[8]對140例通過輔助生育技術(shù)受孕的孕婦和420例孕周等相匹配的自然妊娠孕婦進行比較，用TRFIA進行血清雌三醇等指標(biāo)的三聯(lián)篩查，結(jié)果表明，通過輔助生育技術(shù)妊娠可能會引起各標(biāo)記物的中位數(shù)與中位數(shù)倍數(shù)（MoM）值的差異，可提高產(chǎn)前篩查的檢出率。

4 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）廣泛應(yīng)用于激素、酶、抗體、抗原、維生素等的測量，是將化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種分析檢測方法，檢測結(jié)果靈敏度較高[9]。全自動化學(xué)發(fā)光儀的應(yīng)用使得CLIA比ELISA測定血清雌三醇步驟簡單，測量范圍寬，測定速度快，是目前臨床測定血清雌三醇的常規(guī)方法，但以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)會帶來非特異性反應(yīng)，從而使得各實驗室不同廠家生產(chǎn)的試劑盒檢測結(jié)果的可比性差[10]。唐靜和饒歡歡[11]采用CLIA測定孕婦懷孕中期血清中游離雌三醇等指標(biāo)濃度，數(shù)據(jù)表明，CLIA測定高齡孕婦唐氏篩查陽性率為10.87%，適齡對照組為3.33%，而高通量基因測序產(chǎn)前篩查陽性率為6.52%，說明CLIA可縮小高通量基因測序產(chǎn)前篩查的范圍，對懷有唐氏兒的孕婦不會產(chǎn)生遺漏，又可減少孕檢的相關(guān)費用。鄭雪玲[12]采用CLIA對100例先兆流產(chǎn)孕婦和40例正常孕婦體內(nèi)血清雌三醇及其他相關(guān)指標(biāo)水平進行檢測，聯(lián)合診斷先兆流產(chǎn)的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示，先兆流產(chǎn)繼續(xù)妊娠組和正常組的血清雌三醇與絨毛膜促性腺激素水平明顯高于先兆流產(chǎn)妊娠失敗組，聯(lián)合檢測血清雌三醇水平及相關(guān)指標(biāo)水平可作為預(yù)測先兆流產(chǎn)妊娠結(jié)局的重要指標(biāo)。

5 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）是通過氮氣等惰性氣體為載氣將目標(biāo)分析樣品載入色譜柱上的固定相，目標(biāo)分析樣品在氣固兩相中的分配系數(shù)不同而分離程度不同，再經(jīng)離子源離子化后達(dá)到質(zhì)荷比分離，測定各離子譜峰的強度從而實現(xiàn)定量分析的目的。國際檢驗醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合會（JCTLM）的列表中測定血清雌三醇的參考方法是同位素稀釋氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（IDGC/MS），GC-MS檢測靈敏度較高，但該方法需要衍生化，由于衍生反應(yīng)操作步驟較復(fù)雜，會引入新的誤差從而增加測量不確定度，衍生反應(yīng)的條件要求也非常嚴(yán)格，對試驗人員要求高，衍生過程用時較長，目標(biāo)分析物的質(zhì)譜運行時間長，需要的血清樣本量較大，不利于臨床實驗室推廣。

6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）是將目標(biāo)分析樣品溶液被流動相載入色譜柱內(nèi)，由于目標(biāo)分析樣品溶液中各組分在液固兩相間的分配系數(shù)不同而在色譜柱上的移動速度不同，被分離的單個組分分別從色譜柱中流出后在質(zhì)譜離子源內(nèi)發(fā)生電離反應(yīng)，樣品離子化后變?yōu)闅鈶B(tài)離子，生成荷質(zhì)比不同的帶電離子，帶電離子經(jīng)過加速電場后形成離子束被加速進入質(zhì)量分析器，不同的離子在質(zhì)量分析器中由于質(zhì)荷比大小不同而被分離并依次抵達(dá)檢測器，得到質(zhì)譜譜峰圖從而定性或定量。LC-MS較GC-MS分析檢測的速度快，效率高。

趙昂等[13]采用LC-MS/MS檢測人血清中雌三醇等微量物質(zhì)，經(jīng)過兩步液液萃取后通過丹磺酰氯進行衍生反應(yīng)后進行進行樣品分析，在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下，可以提高離子化效率，最終血清中雌三醇測定結(jié)果精密度最大為6.42%，定量下限為10 ng/L，線性范圍為0.01～5.00 μg/L。LC-MS/MS的靈敏度較高，適用于人體血清中游離雌三醇的分析檢測。但方法需進行衍生化操作，在此基礎(chǔ)上，鄭松柏等[14-15]對前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜條件分別進行了優(yōu)化，省略了衍生化步驟，建立了同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ID-LC/MS/MS），得到了較好的結(jié)果。建立的方法分別對流動相緩沖鹽、流動相梯度、樣品進樣量、萃取溶劑及萃取比例進行了優(yōu)化與研究，最終檢測結(jié)果的線性范圍為0.4～20.0 ng/ml，精密度最大為2.04%。建立的方法特異性好，11種結(jié)構(gòu)類似物對雌三醇定量檢測均無干擾，方法的攜帶污染率低。

綜上所述，血清雌三醇水平的準(zhǔn)確測定在孕期的產(chǎn)前篩查等方面可為臨床提供有價值的數(shù)據(jù)參考，而各檢測技術(shù)都有其特點，在結(jié)果重復(fù)性、操作簡易性、測量范圍等方面均有其優(yōu)缺點，但隨著血清雌三醇檢測技術(shù)的不斷發(fā)展進步，精密度好、靈敏度高、自動化程度高、可為臨床醫(yī)師提供快速準(zhǔn)確檢測結(jié)果的檢測技術(shù)將有很好的臨床應(yīng)用前景。