液體發(fā)酵桑黃總黃酮對抗腫瘤活性及細(xì)胞周期的影響

黃羅丹，安春艷，劉德陽，潘裕添

(閩南師范大學(xué) 菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建 漳州363000)

桑黃是一種中國的傳統(tǒng)藥用真菌，自古以來被奉為珍稀藥材。近幾十年來，國內(nèi)外科學(xué)家們在桑黃的人工栽培技術(shù)、生物學(xué)特性研究、藥理活性研究等方面開展了廣泛的研究[1]。現(xiàn)今已成為國際上公認(rèn)的癌癥治療領(lǐng)域中藥效最為顯著的抗癌真菌之一[2-3]，其抗癌效果顯著高于靈芝、阿加里斯茸等同類真菌[4]。但桑黃抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未定論。本研究從液體發(fā)酵培養(yǎng)的桑黃菌落中提取得到總黃酮，對其藥物毒性以及抗腫瘤活性進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

桑黃菌菌株(由閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程中心提供)，經(jīng)鑒定為火木層菌屬。

1.2 試劑

麥芽浸粉(天津化學(xué)試劑廠)；乙酸乙酯(天津永大試劑廠)；甲醇(山東禹王試劑廠)；胎牛血清(南美PAN Biotech)培養(yǎng)基(MEM1640，美國Gibco公司)；胰蛋白酶，MTS(Amresco)。

1.3 細(xì)胞

小鼠成纖維細(xì)胞L929，人肝癌細(xì)胞HepG-2，上述細(xì)胞均由閩南師范大學(xué)菌物工程產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心提供。

2 體外抗腫瘤實驗

2.1 桑黃菌總黃酮的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)桑黃菌20 d，用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，反復(fù)3次。將萃取物低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至恒重，得到粗提物。菌絲體加入甲醇，超聲破碎，濾去固體后液體同用上述方法萃取，液體蒸發(fā)至恒重。產(chǎn)物用1∶1比例的氯仿∶甲醇洗出，再次蒸發(fā)至恒重，得到粗提物。濾液回收乙醇至無醇味后，分次加到AB-8 大孔樹脂柱上[5]。2 倍柱體積的超純水洗滌，洗滌液棄去。繼續(xù)用5 倍柱體積的體積分?jǐn)?shù)70% 乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，減壓干燥，粉碎，得桑黃總黃酮[5-6]。

2.2 樣品溶液的制備

黃酮溶液的制備：用胎牛血清體積濃度為10%的1640完全培養(yǎng)基稀釋以DMSO溶解的總黃酮配置成100 μg/mL的黃酮溶液，使溶液最后DMSO體積占比為黃酮溶液總體積的0.1%，再經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾除菌。實驗梯度分別設(shè)為10 ,20,50,100 μg/mL，使用時用1640培養(yǎng)基稀釋[7]。

2.3 MTS法檢測細(xì)胞活力

細(xì)胞培養(yǎng)：用胎牛血清體積10%的1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)至處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，加入適當(dāng)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至30×104個/mL，配制成細(xì)胞懸液。按1 mL/皿的量接種于直徑9 cm塑料培養(yǎng)皿中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別用濃度為10 μg/mL，20 μg/mL ，50 μg/mL，100 μg/mL的黃酮樣品溶液10 mL進(jìn)行換液，以體積濃度為10%的1640完全培養(yǎng)基作為空白對照，各3個重復(fù)。

2.4 總黃酮對細(xì)胞的毒性測定

將培養(yǎng)至處于對數(shù)生長期的L929、HepG-2細(xì)胞用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，加入適當(dāng)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個/mL，配制成細(xì)胞懸液。以每孔100 μL接種量均勻接種于96孔板中，靜置30 min，保證細(xì)胞均勻沉淀。將孔板放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將96孔板中舊液去除，加入200 μL的總黃酮樣品溶液，分別設(shè)置濃度為0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，每組8個重復(fù)，以僅加藥但無細(xì)胞組作為背景對照，繼續(xù)培養(yǎng)。分別取24 h，48 h和72 h定時測量。測量前每孔中加入20 μL的MTS，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后在波長490 nm處用酶標(biāo)儀進(jìn)行測量[6-8]。

相對生長率計算公式：RGR值=A樣品組*100%/A樣品空白組。

1) 總黃酮對HepG-2細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)影響。分別選擇24 h，48 h，72h的空白組和加藥組的細(xì)胞拍照，統(tǒng)一放大倍數(shù)為100倍。

2) 總黃酮對腫瘤細(xì)胞周期的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，加入適當(dāng)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至30×104個/mL，配制成細(xì)胞懸液。按1 mL/皿的量接種于直徑為9 cm塑料培養(yǎng)皿中，加入9 mL的體積濃度10%的1640培養(yǎng)基，搖勻，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿中舊液去除，每皿加入10 mL 的含總黃酮的10%的1640稀釋的樣品溶液，設(shè)置濃度為0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，每個濃度3個重復(fù)，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后定時測量。每皿測量前需要用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，冰PBS洗3遍，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，加入70 %乙醇將細(xì)胞沉淀吹打均勻后-20 ℃ 固定4 h，離心去除固定液，再加入999 μL 冰PBS將細(xì)胞沉淀吹打均勻后加入1 μL DAPI染料，避光浸染5 min，37 ℃。上樣，用流式細(xì)胞儀測量，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[9-11]。

3 體外抗腫瘤實驗結(jié)果

3.1 MTS細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

不同質(zhì)量濃度(0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL)的桑黃總黃酮分別作用于L929和HepG-2細(xì)胞24h后，使用酶標(biāo)儀檢測其吸光度值。結(jié)果顯示，隨著桑黃黃酮濃度的梯度增加，L929正常細(xì)胞未發(fā)生分化，且各個濃度藥物對其細(xì)胞活力無明顯抑制作用；而HepG-2細(xì)胞在C組和D組濃度出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的變化，細(xì)胞總活力隨藥物濃度的升高呈梯度降低趨勢。這表明總黃酮在各實驗組質(zhì)量濃度的藥物下對正常細(xì)胞的細(xì)胞活力無明顯抑制作用，而高濃度的劑量條件下(50 μg/mL，100 μg/mL)對HepG-2腫瘤細(xì)胞會促進(jìn)其細(xì)胞形態(tài)分化，抑制其細(xì)胞增殖，如圖1—圖3所示。

(a)對照組 (b)10 μg/mL總黃酮組

(c)50 μg/mL總黃酮組 (d)100 μg/mL總黃酮組圖1 不同濃度桑黃總黃酮對HepG-2細(xì)胞形態(tài)影響Fig.1 Effect of different concentrations of total flavonoids on cell morphology

用不同濃度的桑黃總黃銅樣品溶液分別培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞24 h，48 h，72 h，其細(xì)胞狀態(tài)與空白組對照存在差異， 圖1(a)與圖1(b)箭頭所指細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，隨著培養(yǎng)時間的增長細(xì)胞數(shù)量逐漸增多以及濃度的增大，圖1(c)和圖1(d)圖細(xì)胞形態(tài)由開始的多邊形逐漸生長至有狹長的觸角生成的條狀，基本沒有死細(xì)胞漂浮。

圖2 不同質(zhì)量濃度總黃酮對L929細(xì)胞的毒性檢測結(jié)果Fig.2 Toxicity of different concentrations of Total flavonoids to L929 cells

圖3 不同質(zhì)量濃度總黃酮對HepG-2細(xì)胞的毒性檢測結(jié)果Fig.3 Toxicity of different concentrations of total flavonoids to HepG-2 cells

圖2和圖3中對照組均為藥品作用濃度為0 μg/mL時所測量的吸光度比值。*代表ρ<0.05，**ρ<0.01，***ρ<0.001。

3.2 不同質(zhì)量濃度桑黃總黃酮對L929、HepG-2細(xì)胞周期影響實驗

不同質(zhì)量濃度的桑黃總黃酮分別作用于L929和HepG-2細(xì)胞24 h后，采用流式細(xì)胞儀分析其周期[12-13]。結(jié)果顯示，隨著桑黃黃酮濃度的增加，L929細(xì)胞的細(xì)胞周期總體不同時期細(xì)胞比例大致相同，不隨總黃酮濃度的上升而發(fā)生改變；反之，HepG-2細(xì)胞的G1期細(xì)胞總比例隨黃酮濃度的增加而逐漸減少，S+G2期細(xì)胞總比例隨濃度依賴性上升；表明桑黃總黃酮在實驗組的質(zhì)量濃度下對于正常細(xì)胞的周期無阻滯作用，對于腫瘤細(xì)胞HepG-2的S+G2期有阻滯作用。不同質(zhì)量濃度桑黃總黃酮作用于L929和HepG-2細(xì)胞的周期影響見表1,表2及圖3和圖4。

表1 流式細(xì)胞儀檢測L929細(xì)胞周期

表2 流式細(xì)胞儀檢測HepG-2細(xì)胞周期

(a)對照組 (b)10 μg/ml總黃酮組 (c)50 μg/ml總黃酮組 (d)100 μg/ml總黃酮組圖4 不同質(zhì)量濃度桑黃總黃酮對L929細(xì)胞的周期影響Fig.4 Effects of flavonoids from Phellinus igniarius with different concentrations on the cycle of L929 Cells

(a)對照組 (b)10 μg/ml總黃酮組 (c)50 μg/ml總黃酮組 (d)100 μg/ml總黃酮組圖5 不同質(zhì)量濃度桑黃總黃酮對HepG-2細(xì)胞的周期影響Fig.5 Effects of flavonoids from Phellinus igniarius with different concentrations on the cell cycle of HepG-2 Cells

4 結(jié)束語

在近幾年的實驗研究以及醫(yī)學(xué)治療中，藥用真菌桑黃已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于抗腫瘤方面，作為化療藥物而使用。其主要抗腫瘤有效成分多糖和黃酮在癌癥中的作用機(jī)制，以及如何增強(qiáng)機(jī)體免疫力的原理，現(xiàn)今仍缺乏強(qiáng)有力的研究數(shù)據(jù)。據(jù)科學(xué)研究表明，桑黃的黃酮能夠直接作用于HepG-2腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖，并能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，從而間接達(dá)到抗癌作用。本研究顯示，使用L929正常細(xì)胞與HepG-2腫瘤細(xì)胞在相同的藥物和質(zhì)量濃度條件下，桑黃總黃酮具有體外抗癌作用，并且具有劑量依賴性。本次實驗所用的最大質(zhì)量濃度100 μg/mL對于正常細(xì)胞無明顯毒性作用，在劑量安全性范圍內(nèi)。而桑黃總黃酮抑制細(xì)胞的機(jī)制可能與阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期S+G2期有關(guān)。