鄭 飛,朱維晃*,高昊翔
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微生物還原石墨烯修飾碳?xì)蛛姌O的電化學(xué)特征
鄭 飛1,2,朱維晃1,2*,高昊翔1,2
(1.西安建筑科技大學(xué),陜西省環(huán)境工程重點實驗室,陜西 西安 710055;2.西安建筑科技大學(xué),西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室,陜西 西安 710055)
本文探討了腐敗希瓦氏菌(ATCC 8071)與生物呼吸驅(qū)動下自組裝3D-br-GO修飾碳?xì)蛛姌O之間相互作用的電化學(xué)特性,并且進(jìn)一步探究了施加+0.1V(vs. Ag/AgCl)電勢于生物電極對其相互作用的影響.X射線衍射檢測表明GO在微生物呼吸驅(qū)動下生成了還原態(tài)氧化石墨烯(br-GO).掃描電鏡圖像顯示GO修飾電極表面有大量的br-GO包裹細(xì)菌的復(fù)合結(jié)構(gòu),說明br-GO對微生物具有較好的生物相容性,且由微生物呼吸驅(qū)動得到的三維br-GO自組裝地修飾到生物電極上增加了其比表面積和細(xì)菌負(fù)載量.通過生物膜生長過程中的產(chǎn)電監(jiān)測、循環(huán)伏安法測試,結(jié)果表明GO的修飾有利于細(xì)菌附著于電極形成活性生物膜,促進(jìn)了微生物與電極之間的電子轉(zhuǎn)移.而施加+0.1V(vs. Ag/AgCl)電勢于GO修飾的電極,結(jié)果顯示電極上僅有少量的細(xì)菌負(fù)載,沒有形成活性生物膜,微生物與電極之間的電子轉(zhuǎn)移行為明顯減少,表明施加+0.1V(vs. Ag/AgCl)電勢可能對電極上微生物呼吸生長有抑制作用.
還原態(tài)氧化石墨烯;電極電勢;腐敗希瓦氏菌;電子轉(zhuǎn)移
微生物在呼吸過程中將產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移給細(xì)胞外的電子受體,該過程稱之為胞外電子轉(zhuǎn)移(Extracellular electron transfer, EET)[1].由于EET過程涉及到電子的得失,與環(huán)境介質(zhì)中污染物的還原和降解等過程聯(lián)系密切,因此對生物地球化學(xué)、環(huán)境保護(hù)和能源利用等領(lǐng)域具有重要的參考意義.目前希瓦氏菌屬和地桿菌屬是最具代表性的兩種模式微生物.研究表明希瓦氏菌可以通過膜外c型色素蛋白(OMCs)進(jìn)行直接的電子轉(zhuǎn)移(Direct electron transport, DET),和通過自分泌氧化還原介質(zhì)(如核黃素)進(jìn)行間接的電子轉(zhuǎn)移(Mediated electron transport, MET)[2-3].地桿菌屬,如硫還原地桿菌()只能通過唯一的直接電子轉(zhuǎn)移路徑進(jìn)行胞外電子傳遞[4].胞外電子傳遞的過程受很多因素影響,除菌屬外最重要的兩個因素是電極材料和電極電勢[5-6].理想的電極要求對細(xì)菌有良好的生物相容性[7],能夠滿足多種傳遞路徑實現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移,同時電極要有大的比表面積來負(fù)載更多的微生物量[8],考慮到經(jīng)濟(jì)成本等問題,電極一般使用經(jīng)濟(jì)廉價材料[9].Yuan等[10]采用微生物催化還原氧化石墨烯(GO)得到的石墨烯框架結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移,這種石墨烯框架結(jié)構(gòu)的存在有利于電極上形成活性生物膜.Yong等[8]構(gòu)建了一個自組裝三維還原氧化石墨烯與細(xì)菌雜化的生物膜,這種生物膜實現(xiàn)了MR-1和電極之間的雙向電子轉(zhuǎn)移.通過微生物催化還原形成的石墨烯能增強(qiáng)“微生物-電極”間的相互作用,促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移,但電極的電化學(xué)活性有明顯的延后現(xiàn)象.此外,電極電勢的運用對微生物在電極表面的附著和生物膜的形成也有顯著影響.有研究表明施加正電勢有利于微生物獲得驅(qū)動力向電極表面附著[11-12],但可能對電極表面的生物群落組成有影響[13].在電極電勢作用下,細(xì)菌胞外活性物質(zhì)的表達(dá)存在顯著差異[14-15],生物膜電極上也呈現(xiàn)不同的電子轉(zhuǎn)移機(jī)制[16].石墨烯在不同時間段對電極的修飾,以及外電勢施加的影響對腐敗希瓦氏菌與碳?xì)蛛姌O相互作用過程中的電化學(xué)特征還少有研究.
因此,在不同條件下(氧化石墨烯(GO)添加的不同時間、電極電勢的施加)對腐敗希瓦氏菌呼吸驅(qū)動產(chǎn)生的自組裝三維還原態(tài)石墨烯(br-GO)修飾的電極,以及微生物與br-GO修飾的電極之間的相互作用過程對胞外電子傳遞的影響還值得進(jìn)一步深入研究.基于此,本文探究了不同條件下的br-GO修飾的碳?xì)蛛姌O的生物電化學(xué)活性以及“微生物-電極”之間的電子傳遞特征.研究結(jié)果為認(rèn)識腐敗希瓦氏菌與生物膜電極之間的相互作用特性提供了見解,為今后開發(fā)制備高活性生物膜電極提供了更多的思路.
腐敗希瓦氏菌(ATCC 8071)接種到電化學(xué)電池之前,先在滅菌LB培養(yǎng)基中32℃和150r/min好氧培養(yǎng)12h,至吸光度OD600接近1.0.菌液經(jīng)過離心得到肉紅色細(xì)菌球粒,說明培養(yǎng)成功.然后使菌體重新懸浮于100mL電解液(5%的LB培養(yǎng)基和95%的M9緩沖溶液,包含18mmol/L的乳酸鈉).LB培養(yǎng)基成分為:蛋白胨(10g/L),酵母膏(5g/L),NaCl (5g/L),并用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH接近7.0.M9緩沖液成分為:Na2HPO4(6g/L),KH2PO4(3g/L), NH4Cl(1g/L),NaCl(0.5g/L),MgSO4(1mmol/L),CaCl2(0.1mmol/L).為了形成電化學(xué)活性生物膜.細(xì)菌細(xì)胞懸浮液被轉(zhuǎn)移至單室三電極系統(tǒng)中,然后在懸浮液中加入11mL GO分散液(1g/L),即在反應(yīng)器中得到GO濃度為0.1g/L.在三電極體系下,浸沒于電解液的碳?xì)?1cm×2cm)作為工作電極,且用于細(xì)菌的附著形成生物膜,銀/氯化銀電極(Ag/AgCl/KCl sat.)作為參比電極,鉑絲用于對電極.單室反應(yīng)器通氮氣20min以保證厭氧環(huán)境,然后密封反應(yīng)器,在恒溫32℃水浴,50r/min的磁力攪拌下觀察生物膜形成.相同條件下,11mL GO分散液(1g/L)在生物膜自然生長后的第26h添加設(shè)置對照試驗(CF/GO/26h).同時,在相同條件下,11mL GO分散液(1g/L)在起始時刻添加,且工作電極上施加+0.1V(vs. Ag/AgCl)電勢,設(shè)置實驗組(CF/GO/+0.1V).自然生長的電極生物膜是在不施加任何電勢和不添加GO的條件下形成,作為空白對照(CF).這樣,即CF/GO、CF/GO/26h、CF/GO/ +0.1V、CF四個實驗組.
單室反應(yīng)器中,微生物在GO修飾的電極上生長,包括CF/GO、CF/GO/26h,以及微生物在未經(jīng)GO修飾的電極(CF)上自然生長,工作電極上均不施加電勢,僅用數(shù)據(jù)采集卡記錄工作電極與參比電極間的電勢差,觀察電勢差變化,以此來反映電極上生物膜的生長情況.而在CF/GO/+0.1V實驗組上,采用CHI 660E(上海辰華公司)型電化學(xué)工作站在三電極體系下對工作電極施加+0.1V電勢,觀察電流對時間(i-t曲線)的變化趨勢,以此來反映電極上生物膜的生長情況.循環(huán)伏安(Cyclic voltammetry, CV)通過CHI 660E型電化學(xué)工作站在三電極體系下測試.CV測試在10mV/s的掃描速率下進(jìn)行,電壓掃描范圍為-0.8V~0.7V.
單室反應(yīng)器電解液中的黑色絮狀體br-GO通過過濾,3次水洗和離心,冷凍干燥獲得固體br-GO,用于XRD檢測.電解液中過濾獲得的未經(jīng)離心清洗的br-GO用2.5%戊二醛固定24h然后不同梯度乙醇(25%,50%,75%,85%,95%,100%)脫水,室溫干燥,用于SEM檢測.生物膜電極(碳?xì)?同樣用戊二醛固定,乙醇脫水,干燥后做SEM表征.
由于微生物的呼吸驅(qū)動,棕黃色電解液約在48h后完全變?yōu)楹谏鯛罨旌弦?表明水溶性GO(棕黃色)被還原為br-GO絮狀體(黑色),圖1E和F顯示了br-GO是一個三維的大孔徑分層結(jié)構(gòu).如圖1A所示,未修飾的自然生長的生物膜電極表面較為光滑,僅有少量的細(xì)菌附著在上面.與自然生長的生物膜相比,CF/GO與CF/GO/26h電極表面幾乎被微生物呼吸驅(qū)動下形成的br-GO所覆蓋(圖1B,D),呈現(xiàn)出一種三維立體結(jié)構(gòu),使得電極表面具有更大的比表面積,富集了更多的細(xì)菌,因此有利于活性生物膜在電極表面的形成.圖1C中CF/GO/+ 0.1V電極上雖然也被三維br-GO覆蓋但附著的細(xì)菌相對較少,表明這種電極電勢的施加不利于電極修飾過程的進(jìn)行.電極上微生物菌落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的形態(tài),將會導(dǎo)致生物膜電極的電化學(xué)活性顯現(xiàn)較大差異.
圖1 不同膜電極和br-GO的SEM圖
(A) CF, (B) CF/GO, (C) CF/GO/+0.1V, (D) CF/GO/26h, (E) br-GO and (F) br-GO
XRD圖譜顯示,純石墨粉在26.5°左右有一個強(qiáng)度很高很尖銳的峰(圖2A),這是石墨晶面典型的衍射峰.由Hummers法[17]制備的GO的XRD圖譜顯示在2=11°左右出現(xiàn)了比較尖銳的衍射峰,由布拉格方程(Bragg’slaw)2sin=得GO的層間距為0.8nm(=1)[18].GO被微生物催化還原形成的br-GO,其XRD圖譜顯示11°左右的GO衍射峰消失,而在22.6°左右出現(xiàn)了一個比較寬泛的衍射峰,它的層間距為0.39nm.衍射峰的變化和層間距的減小表明GO在微生物呼吸驅(qū)動下被催化還原成了br-GO[19].
圖2 石墨,GO和br-GO的XRD圖譜
如圖3A所示,經(jīng)過GO修飾的電極(CF/GO, CF/GO/26h)電勢差輸出值與未修飾電極(CF)電勢差輸出值的變化趨勢存在較大差異.CF/GO電極上電勢差隨時間不斷地持續(xù)增大且最終穩(wěn)定在0.51V (vs. Ag/AgCl)左右;CF/GO/26h電極上電勢差在GO加入之后反映出了與CF/GO類似的增長變化趨勢,且最終達(dá)到了最大值約為0.47V(vs. Ag/AgCl);而CF的電極上電勢差變化趨勢非常平緩,始終處于較低的水平,且最大的電勢差輸出值不超過0.1V(vs. Ag/AgCl).GO修飾的電極(CF/GO, CF/GO/26h)電勢差輸出值的變化可以反映出,自組裝三維br-GO修飾的電極表面富集越來越多的微生物,這些微生物細(xì)胞利用基質(zhì)在呼吸的過程中釋放出大量電子,使得電極表面積累的電子密度增加從而使電勢差上升.圖3A也反映出,在生物膜自然生長后的第26h添加GO,電勢差輸出值突然下降,從原來的0.125V左右降低至0.1V以下,這是因為添加GO后微生物釋放的電子有一部分被GO搶奪用于將其還原成br-GO[19],使得微生物與電極間電子傳遞減弱,但是隨后br-GO負(fù)載到電極上促使了微生物與電極間的電子傳遞.有研究表明br-GO生成的初期會對微生物產(chǎn)生抗菌性[20],因為CF/ GO/26h的電極表面已經(jīng)形成了初步的生物膜,微生物細(xì)胞膜外分泌聚合物避免br-GO顆粒對細(xì)菌細(xì)胞造成損害[21],所以經(jīng)GO修飾以后CF/GO/26h電極的生物相容性仍然較好,電極的生物電化學(xué)活性逐漸增強(qiáng).同時值得注意的是第26h添加GO,微生物的適應(yīng)時間(約5h)比起始添加GO(約10h)要縮短近一半,這也是因為CF/GO/26h體系下微生物在前26h在電極上自然生長逐步形成了有活性的穩(wěn)定菌落.
如圖3B所示,CF/GO/+0.1V電極上施加+0.1V (vs. Ag/AgCl)電勢產(chǎn)生的反應(yīng)電流變化微弱,電流輸出值接近于背景值.這表明在GO修飾的電極施加+0.1V(vs. Ag/AgCl)電勢,不利于GO對碳?xì)蛛姌O的修飾過程,GO修飾作用對電極電化學(xué)性能改善沒能充分表現(xiàn)出來,故與未經(jīng)修飾電極有相似的生物參數(shù)特征.雖然電極上施加正電勢有利于細(xì)菌(通常帶負(fù)電荷)向電極的富集,但是過高的正電勢可能會對微生物生長有抑制作用[22],也有研究表明過高的正電勢使微生物細(xì)胞外進(jìn)行直接電子轉(zhuǎn)移的色素蛋白被氧化[23],從而抑制電子傳遞過程.
圖6和圖7所示為生物膜生長過程中各個時間節(jié)點上的CV曲線及電子轉(zhuǎn)移量的變化,反映了微生物與電極間的電子轉(zhuǎn)移的變化趨勢.由圖可知,生物膜自然生長(CF)的CV曲線變化微弱,電子轉(zhuǎn)移量始終較小,說明微生物與電極間的電子轉(zhuǎn)移活動始終處于較弱狀態(tài).其CV曲線上始終出現(xiàn)氧化還原峰,從峰的強(qiáng)度可以看出49.5h左右電極上微生物活性最強(qiáng).文獻(xiàn)研究表明氧化還原峰為電子轉(zhuǎn)移的特征峰,能夠反映電極上的電子傳遞形式,CV測試在不同掃描速率下的氧化還原峰電流與掃描速率或掃描速率的平方根的線性關(guān)系(圖5B),表明其峰電流與掃描速率呈線性關(guān)系,電極界面反應(yīng)過程受吸附控制,其峰電流也與掃描速率的平方根呈正比關(guān)系,電極界面反應(yīng)過程受擴(kuò)散控制,表明了CF電極上的電子轉(zhuǎn)移為直接和間接方式傳遞的[9].在圖6B中CF/GO電極的CV曲線變化十分顯著,電子轉(zhuǎn)移量得到明顯提高,表明微生物與電極間的電子轉(zhuǎn)移為明顯增強(qiáng)的過程,22.5h因3D br-GO在電極表面原位形成,CV的響應(yīng)電流顯著增大,微生物呼吸的定向電子傳遞過程得以啟動.CF/GO/26h體系下,在添加GO修飾之前其CV曲線基本不變(圖6C),但是在GO加入之后,CV曲線的環(huán)繞面積逐漸增大,反映了GO對電極的修飾使得微生物與電極間的電子轉(zhuǎn)移得到增強(qiáng).添加GO之前,CV曲線上出現(xiàn)了一個氧化還原峰,而添加GO后CV曲線上氧化還原峰不再明顯被觀察到,這與前述所得結(jié)果是一致的.圖6D中反映的CF/GO/+0.1V電極CV曲線變化較小,響應(yīng)電流僅有輕微的增加,其電極的電化學(xué)活性遠(yuǎn)沒有CF/GO強(qiáng),這進(jìn)一步表明在施加+0.1V電勢下微生物與電極間的電子傳遞受到了抑制.在0h時刻,CV曲線上出現(xiàn)了一對氧化還原峰(-0.25V和-0.1V附近),反映了初期電極上存在有關(guān)電子轉(zhuǎn)移的活性物質(zhì),在后續(xù)經(jīng)GO修飾和施加+0.1V條件下,該活性物質(zhì)的特征氧化還原峰消失,這與br-GO本身特性和色素蛋白被電勢氧化而失去電子傳遞能力有關(guān).
圖6 不同電極在不同反應(yīng)時間的CV曲線(A)CF,(B)CF/GO,(C)CF/GO/26h,(D)CF/GO+0.1V
Fig.6 Cyclic voltammetry curvesof different bio-electrodes at different reaction times.(A) CF,(B) CF/GO, (C) CF/GO/26h,(D) CF/GO+0.1V
3.1 經(jīng)GO修飾的電極比表面積增加,生物負(fù)荷量增多,形成了高活性電化學(xué)生物膜,促進(jìn)了胞外電子傳遞.GO修飾使微生物與電極間相互作用增強(qiáng)是由于微生物呼吸驅(qū)動催化還原生成的br-GO,它顯示了良好的物理化學(xué)特性.
3.2 在起始時加GO更有利于自組裝三維br-GO結(jié)構(gòu)在原位的形成,生物電極上富集的細(xì)菌更多,微生物與電極間表現(xiàn)出更為活躍的電子傳遞活動,生物膜電極的電化學(xué)活性強(qiáng).添加GO后電極的生物電化學(xué)活性在生物膜生長初期存在明顯的滯后現(xiàn)象,這歸咎于微生物釋放的電子有一部分被GO搶奪用于將其還原成br-GO,使得微生物與電極間電子傳遞減弱,但是隨后br-GO負(fù)載到電極上促使了微生物與電極間的相互作用.
3.3 +0.1V(vs. Ag/AgCl)電極電勢的應(yīng)用,不利于GO對碳?xì)蛛姌O的修飾過程,抑制了電極上活性微生物的生長,影響了電子轉(zhuǎn)移過程,微生物與電極間相互作用減弱.
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Electrochemical characteristics of microbe reduced graphene modified carbon felt electrodes.
ZHENG Fei1,2, ZHU Wei-huang1,2*, GAO Hao-xiang1,2
(1.Key Laboratory of Environmental Engineering, Shaanxi Province, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055;2.Key Laboratory of Northwest Water Resource, Environment and Ecology, Ministry of Education, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055)., 2019,39(2):823~830
In the current study, electrochemical characteristics of interaction betweenATCC 8071 and self-assembled 3D bio-reduced GO (3D-br-GO) modified carbon felt electrodes driven by biological respiration were investigated, and the effect of +0.1V (vs. Ag/AgCl) potential applied to the bioelectrode on the interaction was further explored. X-ray diffraction showed that GO was reduced to br-GO driven by microbial respiration. SEM images showed a large number of br-GO/bacteria composites shaped on the GO-modified electrode surface, which indicated that the br-GO had good biocompatibility, and the self-assembled 3D-br-GO modified electrode could increase its specific surface area and bacterial loading capacity. By monitoring of electricity production during biofilm growth, and testing of cyclic voltammetry, the results showed that the modification of GO was beneficial for the bacteria to attach onto the electrode in order to form active biofilm and enhanced the electron transfer between microbe and electrode. Whereas, the applied potential of +0.1V (vs. Ag/AgCl) on the GO modified electrode resulted in only a small quantity of bacteria colonized on the electrode, and no formed active biofilm. The electron transfer behavior between the microbe and the electrode was significantly reduced, indicating that the applied potential of +0.1V (vs. Ag/AgCl) may inhibit the growth of microorganisms on the electrode surface.
br-GO;electrode potential;;electron transfer
X172
A
1000-6923(2019)02-0823-08
鄭 飛(1992-),男,安徽池州人,西安建筑科技大學(xué)碩士研究生,主要從事微生物燃料電池電極修飾電化學(xué)特征研究.
2018-07-05
國家自然科學(xué)基金資助項目(41373093)
*責(zé)任作者, 教授, zhuweihuang@xauat.edu.cn