CASC2和miRNA-21在STEAMI病人急診PCI前后外周血中的表達(dá)變化

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非編碼RNA(ncRNAs)是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，主要包括微小RNA(micRNAs)、PIWI蛋白相互作用RNA、小干擾RNA、長鏈非編碼RNA(lncRNAs)及調(diào)節(jié)RNA等[1]。micRNAs研究廣泛，且已有大量研究證實(shí)，micRNAs在心血管疾病中發(fā)揮了重要作用[2]。有研究表明，micRNA-1、micRNA-499和micRNA-208在急性心肌梗死(AMI)病人血清中的表達(dá)水平均明顯升高，提示其有望成為診斷急性心肌梗死潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。lncRNAs在ncRNAs中數(shù)量最多、功能最復(fù)雜，近期研究表明，lncRNAs可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等層次調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育，影響各種心血管疾病的病理進(jìn)程[3-4]。有研究表明，微小RNA-21(miRNA-21)作為一種抗凋亡基因參與了心肌缺血再灌注損傷(MIRI)及心肌梗死后的心肌重構(gòu)[5]。而癌易感性候選基因2(CASC2)在急性ST段抬高型心肌梗死(STEAMI)心肌缺血再灌注損傷中是否發(fā)揮作用仍不確定。本研究通過觀察STEAMI病人行急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)前后靜脈血中CASC2及miRNA-21的表達(dá)及其變化，探討兩者在STEAMI中的臨床意義，為STEAMI的臨床診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年12月—2017年5月于青島大學(xué)附屬威海市中心醫(yī)院心內(nèi)科住院的行急診PCI的STEAMI病人55例為STEAMI組，排除STEAMI的32名健康者為健康對(duì)照組，STEAMI組按照行PCI后是否發(fā)生MIRI分為MIRI組(13例)及非MIRI組(42例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①STEAMI診斷均符合世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)(典型胸痛持續(xù)時(shí)間超過30 min；ST段上抬>0.2 mm；血清心肌酶學(xué)升高超過正常值2倍以上)；②發(fā)病至入院時(shí)間在12 h以內(nèi)；③經(jīng)直接PCI處理梗死相關(guān)動(dòng)脈(IRA)的STEAMI病人。MIRI的臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)：①直接PCI開通IRA后2 h內(nèi)發(fā)生的嚴(yán)重心動(dòng)過緩(心率<40次/min)或嚴(yán)重性心律失常(頻發(fā)室性期前收縮、室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng))；②IRA開通后前向血流TIMI分級(jí)≤2級(jí)且除外因造影可見的血栓、栓塞、夾層或痙攣等所致的急性閉塞；③再灌注后心源性休克和持久的左心功能不全(Killip分級(jí)≥2級(jí))需要主動(dòng)脈內(nèi)球囊反搏(IABP)或藥物支持超過1周的低血壓。所有病人排除惡性腫瘤、嚴(yán)重的心力衰竭、嚴(yán)重感染、慢性腎臟病、慢性阻塞性肺疾病等。本研究獲得青島大學(xué)附屬威海市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可，并獲得所有納入研究對(duì)象的同意。

1.2 標(biāo)本的采集及保存 分別采集STEAMI病人急診PCI術(shù)前及術(shù)后24 h內(nèi)的外周靜脈血，即刻用含乙二胺四乙酸(EDTA)紫管抽取2管靜脈血，1管即刻送檢心肌損傷標(biāo)志物，另1管靜置于4 ℃冷藏30 min后，室溫下3 000 r/min離心15 min(離心半徑3 cm)，留取上層血漿于無RNA酶的1.5 mL微量離心管(EP管)中，置于-80 ℃冰箱短期保存。收集所有研究對(duì)象的臨床資料，包括性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、吸煙史、血生化指標(biāo)、心電圖、心臟彩超等。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定CASC2、miRNA-21表達(dá)水平 引物采用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)，內(nèi)參U6引物序列為：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miRNA-21引物序列為：上游5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。CASC2引物序列為：上游5′-CACATTGGACGGTGTTTCC-3′，下游5′-TCCTGTAAGCACAGCTGACA-3′。采用美國Invitrogen公司的總RNA提取試劑盒提取血漿總RNA，采用美國Invitrogen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用美國Invitrogen公司的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒檢測(cè)CASC2、miRNA-21。采用ABI PRISM? 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)CASC2、miRNA-21，每個(gè)樣本均檢測(cè)3次。ncRNAs相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCT法。

1.4 心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清cTnT，采用免疫透射比濁法測(cè)定血清hs-CRP水平，均由威海市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察CASC2、miRNA-21的擴(kuò)增曲線；比較各組CASC2、miRNA-21的表達(dá)水平；分析 CASC2、miRNA-21與cTnT、hs-CRP的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 STEAMI病人CASC2及miRNA-21的擴(kuò)增曲線(見圖1、圖2)

圖2 55例STEAMI病人miRNA-21的擴(kuò)增曲線(重復(fù)3次)

2.2 STEAMI組與健康對(duì)照組臨床特征比較 兩組性別、年齡、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史、低密度脂蛋白膽固醇比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 STEAMI組與健康對(duì)照組臨床特征比較

2.3 各組CASC2、miRNA-21的表達(dá)水平比較 STEAMI組PCI術(shù)前及術(shù)后CASC2、miRNA-21表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PCI術(shù)后MIRI組CASC2及miRNA-21表達(dá)水平低于STEAMI組PCI術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PCI術(shù)后非MIRI組CASC2及miRNA-21表達(dá)水平與MIRI組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、表3。

表2 STEAMI組與健康對(duì)照組CASC2、miRNA-21的表達(dá)水平比較(±s)

與健康對(duì)照組比較，1)P<0.05；與STEAMI組PCI術(shù)前比較，2)P<0.05

表3 MIRI組與非MIRI組CASC2、miRNA-21表達(dá)水平比較(±s)

與MIRI組比較，1)P<0.05

2.4 STEAMI病人PCI術(shù)后外周血CASC2、miRNA-21與cTnT、hs-CRP的相關(guān)性 STEAMI病人PCI術(shù)后外周血CASC2、miRNA-21與cTnT顯著相關(guān)(r=0.35，P=0.04；r=0.45，P=0.03)，與hs-CRP無相關(guān)性(r=0.12，P=0.32；r=0.22，P=0.45)；STEAMI病人PCI術(shù)后外周血CASC2與miRNA-21呈正相關(guān)(r=0.33，P=0.04)。

3 討 論

近十幾年來，急診PCI的廣泛開展使得很多STEAMI病人受益，但某些病人非但沒有受益，甚至發(fā)生急性血流動(dòng)力學(xué)障礙而死亡，這種不良結(jié)果主要?dú)w咎于心肌MIRI。近年來，ncRNAs成為心血管領(lǐng)域基礎(chǔ)研究及臨床研究中的重點(diǎn)。大量研究證實(shí)，microRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞和生物體生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，在心血管疾病中有顯著表達(dá)變化，在心肌梗死診斷中,已成為極具潛力的標(biāo)志物[6]。已有研究建議將miRNA-1、miRNA-133、miRNA-499等作為急性心肌梗死有價(jià)值的標(biāo)志物[7-9]。

miRNA-21在正常心臟中表達(dá)很低，但在各種心力衰竭、心肌肥厚、缺血缺氧等條件下明顯升高[10]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，本研究結(jié)果提示miRNA-21在STEAMI病人中表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組；miRNA-21在急診PCI術(shù)后MIRI組表達(dá)量比非MIRI組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNA-21與cTnT呈正相關(guān)，推測(cè)miRNA-21可能參與了心肌MIRI，與部分研究相符合[11]。有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用熱休克或預(yù)處理誘導(dǎo)miRNA-21可明顯減少心肌梗死面積[12]；還有研究對(duì)心肌梗死病人心肌組織標(biāo)本進(jìn)行了miRNAs表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)心肌梗死的邊緣區(qū)miRNA-21明顯升高[13]。說明miRNA-21在AMI病程中發(fā)揮著重要作用。

lncRNAs是長度為200～100 000 nt、無蛋白表達(dá)功能的RNA分子。近年來研究表明，lncRNAs具有表達(dá)遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等調(diào)控作用，與心臟、血管的生理病理功能以及一些心血管疾病(心律失常、心肌梗死、心肌肥厚和心力衰竭等)的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系[14]。有研究認(rèn)為 lncRNAs不僅是蛋白質(zhì)的支架，更是基因的實(shí)際組織者[15]。張濱[16]提出lncRNAs UCA1可以作為AMI潛在的診斷標(biāo)志和治療靶點(diǎn)，lncRNAs可能是作為miRNA的內(nèi)源性競(jìng)爭性RNA而發(fā)揮心肌保護(hù)功能的。CASC2是近期發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，定位于染色體的10q26，最初發(fā)現(xiàn)其在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)，起到抑癌基因的作用。本研究結(jié)果顯示CASC2在STEAMI組病人中表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組，在急診PCI術(shù)后MIRI組表達(dá)量較非MIRI組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)CASC2可能與miRNA-21共同在AMI病程中發(fā)揮重要作用，并二者可能共同參與了心肌MIRI。

miRNAs不但可以靶向調(diào)控大量的蛋白編碼基因，還可以靶向調(diào)控lncRNAs。已有研究表明，CASC2在腎癌中與miRNA-21存在部分靶向調(diào)控關(guān)系[17]；而二者在AMI病程中關(guān)系如何仍不清楚，對(duì)此進(jìn)行研究對(duì)于揭示ncRNAs與心肌MIRI的關(guān)系極為重要。本研究進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在STEAMI病人外周血中CASC2與miRNA-21呈正相關(guān)，但二者是否存在靶向調(diào)控尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示CASC2與miRNA-21在STEAMI病程中發(fā)揮了重要作用，二者表達(dá)量的變化可預(yù)測(cè)心肌MIRI，并為AMI以ncRNAs為藥物治療靶點(diǎn)等臨床診療提供新的思路。