補(bǔ)腎活血湯對慢性心力衰竭大鼠心功能及免疫炎癥反應(yīng)的影響

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心力衰竭的病理生理機(jī)制復(fù)雜，不僅影響心血管系統(tǒng)，還影響骨骼、肌肉、腎臟、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)。人體內(nèi)存在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，使機(jī)體在細(xì)胞、分子和基因水平上處于動態(tài)平衡。越來越多的證據(jù)提示免疫炎癥反應(yīng)通過促炎性細(xì)胞因子參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，心力衰竭時機(jī)體外周血及心肌局部大量炎癥介質(zhì)活化[1]。補(bǔ)腎活血湯是我院治療慢性心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方劑，長期應(yīng)用于臨床，療效顯著。本研究采用腹腔注射鹽酸阿霉素制備大鼠慢性心力衰竭模型，觀察補(bǔ)腎活血湯對慢性心力衰竭大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)以及血清白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及血清正五聚蛋白3(PTX3)水平的影響，并探討其治療心力衰竭的潛在作用機(jī)制，為補(bǔ)腎活血湯治療慢性心力衰竭提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康成年雄性Wistar大鼠80只，10 周齡，體重(220±20)g，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育中心，許可證號：SCXK(魯)2014-0007，符合一級實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)于青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)清潔級動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分籠飼養(yǎng)，每籠6 只，飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，濕度50%～60%，12 h光照，自由攝食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物試劑與儀器 補(bǔ)腎活血湯：由海慈醫(yī)療集團(tuán)藥劑科提供。湯液密封袋裝，配制成相應(yīng)的劑量組(冰箱-4 ℃冷藏保存)。

補(bǔ)腎活血湯高劑量：每100 mL含生藥量為黨參 100 g，黃芪 50 g，補(bǔ)骨脂 50 g，制附子(先煎)30 g，熟地 70 g，山茱萸 70 g，丹參 70 g，赤芍 50 g，葶藶子(包煎)50 g，大棗 30 g。灌胃10 mL/kg。

補(bǔ)腎活血湯中劑量：每100 mL含生藥量為黨參50 g，黃芪25 g，補(bǔ)骨脂25 g，制附子(先煎)15 g，熟地 35 g，山茱萸35 g，丹參35 g，赤芍25 g，葶藶子(包煎)25 g，大棗15 g。灌胃10 mL/kg。

補(bǔ)腎活血湯低劑量：每100 mL含生藥量為黨參25 g，黃芪12.5 g，補(bǔ)骨脂12.5 g，制附子(先煎)8 g，熟地18 g，山茱萸18 g，丹參18 g，赤芍 12.5 g，葶藶子(包煎)12.5 g，大棗 8 g。灌胃 10 mL/kg。

卡托普利片，每片12.5 mg，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號： 國藥準(zhǔn)字H31022986；產(chǎn)品批號：1402032)。研碎成粉末，配制成5 mg/mL懸濁液供灌胃，每次使用之前搖勻。

鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：H33021980)；IL-6、TNF-α檢測試劑盒由上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司提供，腦鈉肽(BNP)、PTX3的檢測試劑盒，由上海迪奧生物科技有限公司提供。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：高速離心機(jī)、酶標(biāo)分析儀、全自動組織脫水機(jī)；石蠟包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、電熱恒溫水箱；Agilent Sonos 5500多普勒超聲診斷儀(美國 Agilent 公司)、顯微攝像系統(tǒng)(Olympus BX50)。

1.3 動物造模、分組及給藥方法 取健康Wistar雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體質(zhì)量均衡原則，隨機(jī)抽取10只作為空白組，剩余大鼠造模。用滅菌注射用水將阿霉素溶解，配成2 mg/mL的阿霉素溶液。模型組大鼠分別于第1周、3周、5 周腹腔注射阿霉素溶液3 mg/kg，第2周、4周、6 周腹腔注射阿霉素溶液2 mg/kg，每周1次，共注射6次。空白組同時腹腔注射等容積生理鹽水。

適應(yīng)性喂養(yǎng)時死亡2只，造模過程中，大鼠死亡8只，造模存活60只，將存活的造模大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、補(bǔ)腎活血湯低劑量組、補(bǔ)腎活血湯中劑量組、補(bǔ)腎活血湯高劑量組，每組12只。未行造模的大鼠10只為空白組?？瞻捉M、模型組以蒸餾水10 mL/kg 灌胃；卡托普利組給予卡托普利水溶液[10 mg/(kg·d)]灌胃。補(bǔ)腎活血湯組給予補(bǔ)腎活血湯灌胃，按人和動物間等效劑量換算方法[2]，給藥劑量(mg/kg)=人的給藥劑量(mg/kg)×系數(shù)(6.25)，人的給藥劑量按成人每天最大劑量60 mg/kg計(jì)算，補(bǔ)腎活血湯低劑量組、補(bǔ)腎活血湯中劑量組、補(bǔ)腎活血湯高劑量組分別給予補(bǔ)腎活血湯低劑量、中劑量、高劑量10 mL/kg，每日1次。每天灌藥盡量保持在同一時間，連續(xù)給藥4周。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 超聲心動圖檢測 治療14 d后，禁食、不禁水12 h，將大鼠用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，左前胸備皮，仰臥位固定，用G4 iu22 彩色多普勒超聲診斷儀進(jìn)行心臟超聲檢測，10 s 探頭，頻率為10 MHz，深度3.5 cm，以M 型超聲心動圖連續(xù)測量3個不同心動周期左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)及收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，取平均值，按照Teichholtz 公式計(jì)算LVEF和左室短軸縮短率(LVFS)。每組數(shù)據(jù)取連續(xù)3個心動周期的平均值，以評價大鼠心力衰竭程度及心功能狀態(tài)。

1.4.2 IL-6、TNF-α、PTX3及BNP檢測 灌胃4周后，將仰臥于操作臺上的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動脈取血約10 mL，室溫靜止2 h后，采用恒溫離心機(jī)4 ℃以2 500 r/min 離心10 min，吸取血清，按ELISA試劑盒方法檢測血清中IL-6、TNF-α、PTX3及BNP含量，剩余血清置于-20 ℃冰箱凍存。采血后處死動物，剖取心臟，提取心肌組織標(biāo)本1.5 cm3，10%甲醛溶液固定，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 藥物干預(yù)過程中模型組大鼠死亡2只，卡托普利組死亡2只，補(bǔ)腎活血湯低劑量組和中劑量組各死亡1只。空白組大鼠術(shù)后飲食規(guī)律，活動正常，呼吸平穩(wěn)，被毛有光澤，排泄物正常；模型組大鼠飲食及精神狀態(tài)差，活動量明顯減少，呼吸加快，口鼻及肢體遠(yuǎn)端發(fā)紺，被毛缺少光澤，粗亂，皮膚缺乏彈性，出現(xiàn)糞便稀薄等；補(bǔ)腎活血湯各劑量組及卡托普利組大鼠精神狀態(tài)、活動能力、呼吸、皮膚、被毛狀態(tài)、飲食及排泄物等較模型組均有所改善。

2.2 補(bǔ)腎活血湯對慢性心力衰竭大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS 的影響 與空白組比較，模型組LVEDD、LVESD 均明顯增加(P<0.01)，LVEF、LVFS均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組、補(bǔ)腎活血湯各劑量組LVEDD、LVESD均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，卡托普利組、補(bǔ)腎活血湯中劑量組、補(bǔ)腎活血湯高劑量組LVEF、LVFS均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、LVFS比較(±s)

與空白組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 補(bǔ)腎活血湯對慢性心力衰竭大鼠IL-6、TNF-α、PTX3、BNP的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α、PTX3、BNP水平呈現(xiàn)高水平表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明大鼠心力衰竭時炎癥因子明顯升高，心力衰竭時免疫炎癥系統(tǒng)激活。與模型組比較，補(bǔ)腎活血湯中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α、PTX3及BNP的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠IL-6、TNF-α、PTX3、BNP比較(±s)

與空白組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

心力衰竭時壓力和容積負(fù)荷增加、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活所伴隨的高水平兒茶酚胺、腎素、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)以及缺氧和炎癥等多種因素均可刺激細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子。心力衰竭時，除免疫細(xì)胞(主要是激活的單核、巨噬細(xì)胞)之外，血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞均可產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，尤其是被激活而滲入心肌間質(zhì)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞可能是心肌局部促炎癥細(xì)胞因子生成的重要來源[3]。目前的資料提示，這些炎癥介質(zhì)可通過多種環(huán)節(jié)干擾心肌細(xì)胞的生物學(xué)功能，如負(fù)性肌力，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、凋亡，壞死、參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝等[4-7]。治療心力衰竭時通常以調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌異常為基礎(chǔ)，盡管明顯降低了死亡率，但其預(yù)后仍很差。研究證明，心力衰竭作為一個系統(tǒng)性疾病，激活了免疫系統(tǒng)，促使炎性細(xì)胞因子釋放，促使細(xì)胞聚集在炎性區(qū)域，刺激細(xì)胞的增殖、分化[8]。

TNF-α、IL-6在免疫學(xué)異常機(jī)制中起關(guān)鍵作用[6]。TNF-α主要來源于心力衰竭時的心臟，主要由激活的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生，主要有對心肌及乳頭肌負(fù)性肌力作用、導(dǎo)致左室收縮功能抑制、促進(jìn)左心室重塑的作用。心力衰竭時TNF-α升高的水平與心力衰竭的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，TNF-α是反映心力衰竭嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，是心力衰竭病人死亡的獨(dú)立預(yù)測因子[9]。IL-6來源于單核或巨噬細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。有研究顯示IL-6 在慢性心力衰竭病人體內(nèi)的含量呈增加狀態(tài)，其水平與慢性心力衰竭的嚴(yán)重程度有著緊密聯(lián)系[10]。IL-6可導(dǎo)致心肌內(nèi)產(chǎn)生高濃度一氧化氮(NO)，抑制心臟乳頭肌的收縮力，同時，高濃度NO也可促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。IL-6是心力衰竭獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，也是反映早期心力衰竭的敏感指標(biāo)[11]。正五聚蛋白家族(PTXs)是一個參與炎性反應(yīng)及免疫應(yīng)答過程的保守多功能模式識別蛋白超家族。根據(jù)其主要結(jié)構(gòu)的長度，可分為短正五聚蛋白和長正五聚蛋白。短正五聚蛋白包括C-反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白P(SAP)。PTX3是構(gòu)成長正五聚蛋白的主要成員。PTX3在炎癥因子的刺激下主要由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表達(dá)，具有抑制成纖維細(xì)胞生長因子的作用，同時抑制血管再生，具有延緩心室重塑的功能[12]。CHF病人血漿PTX-3水平與心功能等級呈正相關(guān)[13]。

BNP是由心室在容積擴(kuò)張和壓力負(fù)荷增加時合成和分泌的一種心臟神經(jīng)激素，與心力衰竭后心室的重構(gòu)密切相關(guān)，BNP水平檢測已經(jīng)成為心力衰竭診斷及評估預(yù)后的金指標(biāo)。

慢性心力衰竭屬中醫(yī)學(xué)“水腫”“喘證”“痰飲”“胸痹”等范疇，病機(jī)總屬本虛邪實(shí)。本虛又以腎虛為主，慢性心力衰竭多見于中老年人，《素問·上古天真論篇》曰：“五八，腎氣衰，發(fā)墮齒槁……七八……天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極?！甭孕牧λソ卟〕梯^長，病情反復(fù)發(fā)作，纏綿難愈，久病也必然影響到腎，正如《景岳全書》云：“五臟之傷，窮必及腎”。 瘀血在邪實(shí)中占重要地位，中醫(yī)素有“久病多瘀”之論。腎為先天之本，五臟精氣之盛衰，功能之強(qiáng)弱，與腎之精氣充盈與否密切相關(guān)，腎氣衰敗，血行瘀滯，阻滯脈絡(luò)，往往出現(xiàn)虛實(shí)夾雜。本課題組研制的補(bǔ)腎活血湯，方劑組成有制附子、補(bǔ)骨脂、熟地、山萸肉、黨參、黃芪、丹參、赤芍、葶藶子、大棗。方中附子、補(bǔ)骨脂益腎陽，熟地、山茱萸滋腎陰，黨參、黃芪益脾肺之氣，丹參、赤芍活血通絡(luò)，葶藶子瀉肺利水，大棗養(yǎng)血緩中。諸藥合用，溫而不燥，補(bǔ)而不滯，共奏益腎活血，利水通脈之功?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)：附子、補(bǔ)骨脂、熟地、山茱萸等補(bǔ)腎藥能增加心肌收縮力，尤其對衰弱的心肌作用更強(qiáng)，并能調(diào)節(jié)心臟的功能，增加心肌供氧，有利于心力衰竭的改善；黨參可降低排血前期(PEPI)/左室排血時間(LVET)比值，增強(qiáng)左心功能，抑制血小板黏附和聚集；黃芪中的黃芪皂苷對心肌有正性肌力的作用，與強(qiáng)心苷類藥物相似；葶藶子強(qiáng)心利尿；丹參可增加心肌三磷酸腺苷(ATP)含量。既往研究顯示，補(bǔ)腎活血湯可降低慢性心力衰竭大鼠血清可溶性凋亡調(diào)節(jié)因子(sFas)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)水平，從而減少心肌細(xì)胞凋亡和抑制左室重構(gòu)，防治心力衰竭[14]。

本研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血湯可明顯改善心力衰竭大鼠心功能及血清IL-6、TNF-α、PTX3、BNP水平，調(diào)控心力衰竭時大鼠細(xì)胞因子及神經(jīng)內(nèi)分泌水平，減少心力衰竭炎癥細(xì)胞因子分泌、改善神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂、干預(yù)心室重構(gòu)、抑制心力衰竭，對改善慢性心力衰竭免疫炎癥反應(yīng)以及預(yù)后具有積極意義。