中性粒細(xì)胞和微粒在炎癥性腸病中促凝機(jī)制的研究進(jìn)展

曹 旭，張武劍，李 桃

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院群力院區(qū)麻醉科，哈爾濱 150001)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)，其發(fā)病率和病死率逐年升高[1]，雖然目前認(rèn)為其發(fā)病是由于基因易感性及環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的腸黏膜異常炎癥應(yīng)答，但具體機(jī)制仍不清楚。IBD是一類病因不明、反復(fù)發(fā)作的慢性腸道疾病[2]。IBD存在高凝狀態(tài)和增加的血栓栓塞事件[3]。血細(xì)胞和微粒是血液中主要受炎癥影響的原始成分，其中巨噬細(xì)胞主要通過釋放細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)在IBD中發(fā)揮促凝作用。IBD患者內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制是腸道局部炎性物質(zhì)能夠損傷微血管內(nèi)皮細(xì)胞，直接和間接激活血小板，從而促進(jìn)血栓形成。既往文獻(xiàn)多以研究IBD與血小板凝血物質(zhì)及凝血功能變化的相關(guān)性為主，研究方向較局限。臨床中中性粒細(xì)胞在IBD中的作用有爭議，一方面介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]，一方面參與組織修復(fù)[5]，因此全面了解中性粒細(xì)胞在IBD中的作用及機(jī)制尤為重要?，F(xiàn)主要對(duì)中性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)和促凝作用明確的微粒在IBD并發(fā)血栓栓塞事件中的機(jī)制進(jìn)行全面概述，從而為IBD血栓事件的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 中性粒細(xì)胞在IBD的作用

中性粒細(xì)胞灌注是感染性結(jié)腸炎和IBD等急性腸炎的重要標(biāo)志，腸上皮細(xì)胞有分泌趨化炎性因子和誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞跨上皮遷移的潛能。在IBD活動(dòng)期，大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞灌注到腸黏膜，其中中性粒細(xì)胞在IBD炎癥進(jìn)展中發(fā)揮不可或缺的作用。一旦中性粒細(xì)胞浸潤到腸黏膜就會(huì)通過釋放活性氧類、一氧化氮、溶酶體酶、花生四烯酸代謝物和細(xì)胞因子等物質(zhì)發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，此外，中性粒細(xì)胞還能釋放NETs殺滅病原體。這些作用對(duì)于機(jī)體成功地防御腸外病原體和炎癥的適當(dāng)緩解起重要作用。但是這個(gè)過程沒有被嚴(yán)謹(jǐn)有序地控制好時(shí)，中性粒細(xì)胞就會(huì)被過度激活，成為IBD中重要的促炎、促凝因素。

1.1中性粒細(xì)胞主要通過表達(dá)組織因子促進(jìn)血栓的形成 中性粒細(xì)胞促進(jìn)血栓形成的能力在IBD血栓形成中也有重要作用。事實(shí)上，中性粒細(xì)胞已被證明在小鼠深靜脈血栓形成模型中必不可少[6]。此外，在小鼠的小動(dòng)脈，它們首先被招募到激活的內(nèi)皮細(xì)胞周圍，從而促進(jìn)血小板活化和纖維蛋白生成[7]。Maugeri等[8]研究表明，中性粒細(xì)胞激活后表達(dá)組織因子。在小鼠模型中，在提睪肌小動(dòng)脈激光損傷部位的中性粒細(xì)胞表達(dá)組織因子，并且黏附在內(nèi)皮表面引起血栓形成[7]。同時(shí)，中性粒細(xì)胞源性的微粒也表達(dá)組織因子。在硫酸葡聚糖處理后的UC小鼠模型中，提睪肌小動(dòng)脈血栓形成增強(qiáng)和血漿凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物水平升高，抑制組織因子后所有這些指標(biāo)明顯降低[9]。抑制組織因子也能減少沿結(jié)腸靜脈黏附的血小板、白細(xì)胞的數(shù)量和組織損傷，表明組織因子參與腸道炎癥的發(fā)病機(jī)制和相關(guān)的血栓性事件[10]。此外，中性粒細(xì)胞還可產(chǎn)生中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G兩種促凝酶。這些酶能損傷內(nèi)皮細(xì)胞激活血小板，促進(jìn)血栓的形成。在三氯化鐵誘導(dǎo)的血管損傷中，這些酶還能水解組織因子途徑抑制物使其失活，從而導(dǎo)致抗凝系統(tǒng)功能減弱[10]。組織因子的增高促進(jìn)凝血瀑布級(jí)聯(lián)激活和凝血酶生成，凝血酶生成同時(shí)也能進(jìn)一步激活血小板。所有這些過程均增加了IBD患者的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。

1.2IBD患者的中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞外誘捕網(wǎng) NETs釋放是中性粒細(xì)胞的一種新的死亡方式，也是中性粒細(xì)胞增加病原體殺傷及炎癥反應(yīng)的新方式。中性粒細(xì)胞在多種病原體和佛波酯等物質(zhì)刺激下，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，激活中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和肽精氨酸脫亞胺酶4，促使染色質(zhì)去致密化，顆粒膜和核膜破裂，釋放以染色質(zhì)為骨架結(jié)合多種顆粒酶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)到細(xì)胞外[11]。自2004年NETs發(fā)現(xiàn)以來，其各方面的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。NETs既在病原菌防御中發(fā)揮重要作用，也能對(duì)宿主引起毒性反應(yīng)。實(shí)際上，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NETs可以參與急性胰腺炎、肺炎、肝臟缺血再灌注損傷等多種器官和組織損傷過程，這些過程可能與組蛋白、蛋白酶、活性氧等多種物質(zhì)有關(guān)[12]。探究NETs對(duì)腸組織的損傷作用有利于進(jìn)一步揭示中性粒細(xì)胞在IBD發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。炎癥是IBD疾病發(fā)生和發(fā)展的主要表現(xiàn)，NETs是一種連接先天免疫和炎癥之間新的識(shí)別方式，有研究表明NETs在UC通過呈遞白細(xì)胞介素1β介導(dǎo)活動(dòng)時(shí)期的腸損傷，通過攜帶組織因子促凝，而在CD的腸組織中無NETs的存在[13]。體外研究表明，NETs破壞培養(yǎng)的人腸上皮樣細(xì)胞Caco-2/TC7細(xì)胞的F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[14]，然而在IBD動(dòng)物模型中，NETs對(duì)分離的腸上皮細(xì)胞和體內(nèi)腸上皮的損傷作用以及具體機(jī)制并不十分清楚。此外，NETs也能與巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等相互作用，刺激其釋放炎性因子等介質(zhì)加重炎癥反應(yīng)。

1.3中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞外誘捕網(wǎng)促進(jìn)IBD的血栓形成 NETs是以染色質(zhì)纖維為平臺(tái)，網(wǎng)絡(luò)顆粒蛋白如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶或高遷移率族蛋白B1，這些成分負(fù)責(zé)NETs的促炎癥促凝血性能。NETs雖然能誘捕病原體和防止其傳播使暴露于高濃度的抗微生物因子，但也能夠誘導(dǎo)血小板黏附、活化和聚集，促進(jìn)血栓形成。NETs參與血栓形成，通常是由配體結(jié)合中性粒細(xì)胞Toll樣受體2和4或IgG復(fù)合物的受體[15]。體外研究表明NETs可以通過血小板依賴和非依賴方式參與凝血系統(tǒng)的激活，還能網(wǎng)絡(luò)并激活血小板、紅細(xì)胞等，為血栓形成提供平臺(tái)和支架；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明NETs參與動(dòng)物多種實(shí)驗(yàn)性血栓模型和人靜脈血栓等的形成[16-17]。此外，NETs形成的標(biāo)志物與人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重性相關(guān)并為促栓狀態(tài)提供證據(jù)。NETs也參與體內(nèi)靜脈和動(dòng)脈血栓形成過程。

2011年有研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸組織中可能存在NETs[18]，2015年IBD雜志發(fā)表的一篇研究表明，通過蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在UC患者組織標(biāo)本中有11種與中性粒細(xì)胞以及NETs有關(guān)的蛋白質(zhì)升高，包括髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶9和組織蛋白酶G[19]。這些數(shù)據(jù)已通過顯微鏡觀察到得以驗(yàn)證，并顯示在成人UC患者而不在CD患者的腸組織中存在[13]，而在兒科的UC和CD患者小腸和結(jié)腸組織中均有大量NETs[20]。CD的危險(xiǎn)因素(抗生素相關(guān)的腸道菌群失調(diào)、腸微生物)在動(dòng)物模型中能刺激更多的NETs釋放[21]。He等[22]也提出NETs是IBD高凝狀態(tài)的原因，IBD患者中性粒細(xì)胞在體外刺激后，相比于對(duì)照組能釋放更多的NETs。在同一項(xiàng)研究中，活動(dòng)性疾病患者血清處理中性粒細(xì)胞，NETs釋放率升高。表明這些IBD患者擁有能夠誘導(dǎo)NETs生成的血清微環(huán)境。這可能是由于患者血清中的抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體能夠刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs?？怪行粤＜?xì)胞胞質(zhì)抗體實(shí)際上是針對(duì)NETs成分，如髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G或蛋白酶3的抗體。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體可能會(huì)引發(fā)NETs釋放，通過暴露中性粒細(xì)胞抗原參與抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體產(chǎn)生的放大反應(yīng)。NETs除具有促進(jìn)血栓形成的表型外，也有助于小血管炎[23]和纖溶亢進(jìn)[24]，引起IBD腸道組織損傷和隨后的出血。因此，NETs可能還在胃腸道出血中發(fā)揮重要作用。

基于以上研究推斷，NETs可能參與IBD組織損傷、炎癥進(jìn)展和高凝狀態(tài)等過程，進(jìn)一步探究NETs參與IBD的機(jī)制有助于深入發(fā)掘先天性免疫在IBD中發(fā)揮的作用，為IBD的治療提供新方向。

2 微粒在IBD中的作用

當(dāng)血管內(nèi)的細(xì)胞(包括血液細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞)被激活、損傷后或發(fā)生凋亡時(shí)，就會(huì)有直徑為0.1～1.0 μm的微囊泡從細(xì)胞膜脫落，這些釋放入血的小囊泡稱為微粒。微粒攜帶該微粒來源細(xì)胞的部分蛋白，所以具有相應(yīng)母細(xì)胞的表型和功能。微粒既能發(fā)揮一定的生理和病理功能，又能作為一種標(biāo)志物，反映細(xì)胞的激活和疾病的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，它的一些生物學(xué)活性與疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。目前，微粒主要功能有促凝、促炎、調(diào)節(jié)免疫等，此外它還能作用于內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)血管生長、調(diào)節(jié)血管收縮。循環(huán)微粒水平在各種心血管疾病、慢性炎癥性疾病中升高，并發(fā)揮一定的作用。微粒也是IBD中重要的促炎、促栓因素。對(duì)于它的認(rèn)識(shí)還在不斷的探索，其研究也越來越多。微粒的研究對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)炎癥性疾病IBD的發(fā)生、發(fā)展和血栓栓塞性并發(fā)癥的防治具有重要臨床意義。

2.1IBD患者微粒水平增高 2005年Chamouard等[25]首次發(fā)現(xiàn)CD患者總的循環(huán)微粒升高，而且釋放的微粒與CD相關(guān)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，治療疾病的特效藥英夫利昔單抗也能顯著降低微粒水平。根據(jù)微粒的來源將微粒分為血小板微粒、粒細(xì)胞微粒、紅細(xì)胞微粒、內(nèi)皮微粒及淋巴細(xì)胞微粒等。血小板微粒和內(nèi)皮細(xì)胞微粒占循環(huán)微粒的主要部分，所以其研究較多，但白細(xì)胞微粒在炎癥方面的作用也逐漸被廣泛認(rèn)識(shí)到。與健康人相比，活動(dòng)CD患者總循環(huán)微粒、血小板微粒、粒細(xì)胞微粒、內(nèi)皮微粒均增加，總的微粒在活動(dòng)性患者中比非活動(dòng)性明顯增高，而且與炎癥的活動(dòng)性指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白相關(guān)。

2.2微粒在介導(dǎo)IBD炎癥中的作用 在IBD中，體內(nèi)分離和體外誘導(dǎo)血小板產(chǎn)生的血小板微粒能夠提高腸道環(huán)加氧酶2的表達(dá)，增加活性氧類的產(chǎn)生，從而加重炎癥反應(yīng)[26]。Andoh等[27]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血小板微粒水平與IBD臨床活動(dòng)性和血小板聚集活性相關(guān)。這些結(jié)果表明，血小板微粒是IBD患者血小板活化狀態(tài)有用的標(biāo)志物。同時(shí)，活動(dòng)期IBD高水平循環(huán)血小板微粒表明，血小板在IBD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞微粒是第二大循環(huán)微粒。它主要通過內(nèi)皮細(xì)胞的活化或凋亡產(chǎn)生。在IBD中，內(nèi)皮細(xì)胞微粒能夠增加血液的高凝狀態(tài)，促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)血管張力，這與內(nèi)皮細(xì)胞微粒表面表達(dá)的相關(guān)活性分子有關(guān)[28]。Leonetti等[29]將從CD患者外周血提取的微粒注射到正常的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張和腸系膜小動(dòng)脈血流誘導(dǎo)的擴(kuò)張功能受到損傷。一氧化氮合酶抑制劑能逆轉(zhuǎn)這種損傷，這與一氧化氮、活性氧類和環(huán)加氧酶代謝產(chǎn)物釋放之間平衡的微妙改變有關(guān)。說明CD患者的微粒能大大改變內(nèi)皮和血管功能，因此微粒可能在CD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，至少部分導(dǎo)致不可控制的血管炎癥相關(guān)的腸道損傷。

2.3微粒促進(jìn)IBD高凝狀態(tài) 微粒通過帶負(fù)電荷的磷脂表面和促凝蛋白如組織因子暴露促血栓形成。新的證據(jù)表明，血細(xì)胞微?？赡軐?dǎo)致IBD的血栓前狀態(tài)[29]。暴露于血液中的組織因子是外源性凝血途徑的始動(dòng)因素，是主要的啟動(dòng)凝血因子。組織因子作為外源性凝血途徑的啟動(dòng)者，在IBD患者腸黏膜損傷后，內(nèi)皮下組織因子暴露增多[30]。而腸外血栓形成的組織因子來源于循環(huán)血細(xì)胞表面表達(dá)和微粒釋放。在對(duì)組織因子陽性微粒研究中，IBD患者較對(duì)照組增高，雖然Palkovits等[31]得出組織因子陽性微粒與患者高凝狀態(tài)(D-二聚體水平)不相關(guān)。但大部分研究表明，來自腸道血管內(nèi)帶有組織因子的微粒進(jìn)入全身循環(huán)是炎癥導(dǎo)致血栓形成的發(fā)病機(jī)制之一[27-30]。而He等[22]用敏感的磷脂酰絲氨酸探針乳黏素，證明活動(dòng)性IBD的總磷脂酰絲氨酸陽性微粒和血小板微粒明顯增高，并且微粒表面暴露的磷脂酰絲氨酸在IBD高凝狀態(tài)及血栓形成中發(fā)揮主要作用。在兒科胃腸病研究中，Deutschmann等[32]研究表明微粒的促凝活性在活動(dòng)性、靜止性CD和活動(dòng)性UC患者中顯著增高，來源于IBD兒童患者微粒的凝血酶生成能力明顯增高，它可能是通過微粒表面表達(dá)組織因子或循環(huán)血細(xì)胞傳遞組織因子到血栓部位引發(fā)腸外血栓形成的[33]。

凋亡的細(xì)胞及活化的血小板均產(chǎn)生微粒，在急性冠狀動(dòng)脈綜合征中，Mallat和Tedgui[34]利用膜連蛋白Ⅴ與微粒表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合的特性分析急性冠狀動(dòng)脈綜合征外周血中微粒升高的意義，表明外周血中微粒水平增高有利于預(yù)測血栓形成及心肌缺血。提示微粒也能預(yù)測IBD患者血栓及腸潰瘍形成。

3 結(jié) 語

IBD患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的最可能原因是IBD疾病本身相關(guān)的炎癥，而這種高凝狀態(tài)和血栓動(dòng)態(tài)反過來參與慢性腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。通過靶向降低血小板和白細(xì)胞數(shù)量和微粒水平，抑制NETs的生成，能進(jìn)一步預(yù)防和治療IBD血栓栓塞的發(fā)生。闡明IBD中高凝狀態(tài)的機(jī)制不僅有利于防治血栓并發(fā)癥的發(fā)生，也有利于控制疾病炎癥狀態(tài)和進(jìn)一步發(fā)展。認(rèn)識(shí)到炎癥和凝血之間在IBD中的聯(lián)系，有助于深入發(fā)掘凝血系統(tǒng)在IBD中發(fā)揮的作用，為IBD的治療提供新方向，靶向減少炎癥-凝血的相互作用，有利于降低IBD患者發(fā)病率和病死率。