環(huán)狀RNA在免疫應(yīng)答及肺部感染性疾病中的作用

張夢潔，繆紅軍

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院急診/重癥醫(yī)學(xué)科，南京 210008)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高度保守，具有組織特異性和發(fā)育階段特異性。circRNA作為基因組中調(diào)節(jié)基因研究的熱點(diǎn)，具有非常復(fù)雜的生物學(xué)功能，包括作為微RNA(microRNA，miRNA)海綿、調(diào)控親本基因表達(dá)、結(jié)合RNA結(jié)合蛋白、編碼蛋白質(zhì)等重要功能。研究證實，大量穩(wěn)定且保守的circRNA在人類細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控中扮演著重要角色[1]。近些年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用，其在一些肺部感染性疾病中也呈差異性表達(dá)[2-4]，其原因可能與circRNA直接或間接作用于miRNA，參與調(diào)控免疫反應(yīng)、巨噬細(xì)胞極化以及抵抗病原微生物感染等有關(guān)。目前circRNA在感染性疾病中的研究尚不多，但已引起了眾多研究者的注意?，F(xiàn)就circRNA的特征與生物學(xué)功能及其在免疫應(yīng)答調(diào)控、抗病毒免疫以及肺部感染性疾病的中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為肺部感染性疾病的研究與防治提供新視角和新策略。

1 circRNA的特征及生物學(xué)功能

1.1circRNA的特征 1976年，Sanger等[5]首次提出了circRNA的概念。早期，circRNA被認(rèn)為是錯誤剪接的產(chǎn)物，因而在很長一段時間內(nèi)關(guān)于circRNA的研究一直處于停滯狀態(tài)。近年來，隨著RNA測序和生物信息分析技術(shù)的飛速發(fā)展，科學(xué)家們對circRNA進(jìn)行了更深入的研究。研究證實,circRNA具有以下特征：①circRNA是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA，與傳統(tǒng)線性RNA相比，無游離的5′端和3′端，不易被核酸外切酶RNase R降解，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；②數(shù)量龐大，具有一定的組織特異性；③富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)；④外顯子來源的circRNA占大部分，并主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能，小部分內(nèi)含子來源以及外顯子與內(nèi)含子組成的circRNA主要在胞核內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用[6-9]。

1.2circRNA的生物學(xué)功能 近年來,關(guān)于circRNA生物學(xué)功能的報道越來越多，主要集中在與miRNA調(diào)控的關(guān)系上。circRNA上具有豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠競爭性結(jié)合miRNA，起到miRNA海綿體的作用，從而解除miRNA對靶基因的抑制作用，增加靶基因的表達(dá)水平[10]。小腦退行性相關(guān)蛋白基因1(cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1)反義鏈轉(zhuǎn)錄生成的circRNA分子CDR1as/ciRS-7廣泛存在于人和小鼠的大腦中，ciRS-7含有73個miR-7結(jié)合位點(diǎn)，與miR-7海綿吸附后可明顯抑制miR-7的功能，同時也可使miR-7作用靶點(diǎn)的表達(dá)水平明顯增高[11]。另外研究發(fā)現(xiàn)，部分circRNA具有與蛋白質(zhì)相互作用、調(diào)控親本基因表達(dá)、編碼蛋白質(zhì)以及作為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子調(diào)控基因表達(dá)等生物學(xué)功能[12-14]。circ-叉形頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞型3(forkhead box O 3，F(xiàn)OXO3)能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2、p21形成三元復(fù)合物，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程[13]。而circ-FOXO3與MDM2(murine double minute 2)結(jié)合可促進(jìn)p53的泛素化和降解，并抑制FOXO3蛋白的泛素化和降解，從而抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

2 circRNA在免疫細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控

巨噬細(xì)胞是一類重要的免疫細(xì)胞，是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，最早產(chǎn)生于胚胎發(fā)育時期的卵黃囊和肝前體細(xì)胞，后進(jìn)入肺部并定居，形成肺泡巨噬細(xì)胞，而肺泡巨噬細(xì)胞是肺組織的首要防線[16]。在肺部感染性疾病如急性肺損傷等的發(fā)生發(fā)展中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮著促炎和抗炎雙重作用。而近期研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在巨噬細(xì)胞中豐富表達(dá)，并參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的促炎和抗炎作用[17-19]。

巨噬細(xì)胞受到微生物病原體、脂多糖等特定因素刺激后特異性表達(dá)circRNA，如人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后circRNA顯著差異性表達(dá)[20]；小鼠巨噬細(xì)胞受脂多糖刺激后特異性表達(dá)circRNA——mcircRasGEF1B，并以核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)依賴的方式表達(dá)[17]。在脂多糖/Toll樣受體4信號通路中，mcircRasGEF1B可正向調(diào)控細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)，而敲除mcircRasGEF1B降低了脂多糖誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)[17]。ICAM-1對于白細(xì)胞向炎癥部位的募集至關(guān)重要，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，mcircRasGEF1B與細(xì)胞周期進(jìn)程、有絲分裂、活性代謝、NF-κB、脂多糖信號通路以及巨噬細(xì)胞極化有關(guān)[21]。以上研究支持circRNA在巨噬細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、巨噬細(xì)胞極化以及抵抗微生物感染。

circRNA參與調(diào)控巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。Deng等[18]發(fā)現(xiàn)，mmu_circRNA_007893在降鈣素基因相關(guān)肽刺激后顯著上調(diào)表達(dá),沉默mmu_circRNA_007893，降鈣素基因相關(guān)肽誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6信使RNA的表達(dá)顯著下降，但mmu-miR-485-5p的表達(dá)顯著增加；而過表達(dá)mmu-miR-485-5p，IL-6信使RNA的表達(dá)顯著下降。上述研究表明，mmu_circRNA_007893可能作為mmu-miR-485-5p的海綿，調(diào)節(jié)下游炎性因子IL-6信使RNA的產(chǎn)生。因此，mmu_circRNA_007893具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。

巨噬細(xì)胞受局部微環(huán)境刺激后會被激活并極化成不同亞型，發(fā)揮不同的功能。巨噬細(xì)胞亞型(M1型巨噬細(xì)胞和 M2型巨噬細(xì)胞)在特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)以及疾病的發(fā)展和恢復(fù)中起關(guān)鍵作用。M1型巨噬細(xì)胞可由γ干擾素、脂多糖等誘導(dǎo)產(chǎn)生，有促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒作用，其也參與腫瘤的抑制和免疫刺激，但不受調(diào)控的過度產(chǎn)生可導(dǎo)致機(jī)體正常組織的炎癥損傷[22]。M2型巨噬細(xì)胞可由IL-4、IL-10、IL-13、糖皮質(zhì)激素等誘導(dǎo)產(chǎn)生，主要發(fā)揮抗炎作用，有促進(jìn)損傷修復(fù)和組織再生的功能[23]。因此，若能選擇性激活M2型巨噬細(xì)胞會減輕炎癥癥狀并促進(jìn)組織修復(fù)。Zhang等[19]研究表明，circRNA參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，通過微陣列分析技術(shù)比較巨噬細(xì)胞在不同極化條件下(M1和M2)circRNA的表達(dá)譜，共篩選出189條差異表達(dá)的circRNA，表明circRNA的表達(dá)在不同極化條件下不斷改變，且circRNA-010231與miR-6950-5p、miR-19-2-5p、miR-141-5p、miR-1964-5p以及miR145a-3p有結(jié)合位點(diǎn)，故推測circRNA可能通過與miRNA相互作用，參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化。因此，了解circRNA與miRNA相互作用調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的具體分子機(jī)制，對未來選擇性激活M2型巨噬細(xì)胞，減輕炎癥損傷具有重要意義，為肺部感染性疾病(如急性肺損傷等)的防治提供新視角。

3 circRNA參與抗病毒免疫反應(yīng)

最近，有研究揭示了circRNA在誘發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)中的新功能，這或許為未來研究病毒性肺炎的診斷與治療提供了新見解。在轉(zhuǎn)染體外純化的circRNA到哺乳動物細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，circRNA可誘導(dǎo)先天免疫基因的表達(dá)，從而保護(hù)宿主免受病毒感染[24-26]。視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ是識別外源circRNA的重要核酸傳感器，其對circRNA的識別是先天免疫信號的關(guān)鍵。這種識別激活了先天免疫反應(yīng)，并提供了抵御病毒感染的保護(hù)措施。在宿主抗病毒防御系統(tǒng)中，視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ、黑色素瘤分化相關(guān)基因5以及Toll樣受體3等雙鏈核糖核酸結(jié)合蛋白是宿主抗病毒防御系統(tǒng)的關(guān)鍵因子，這些蛋白質(zhì)將病毒RNA螯合在抗病毒效應(yīng)分子上，從而引發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答。

Li等[27]使用全基因組文庫篩選與circRNA生物合成相關(guān)的基因，其中包括與抗病毒免疫相關(guān)的免疫因子NF90/NF110。NF90/NF110在宿主對病毒感染的免疫防御中起重要作用，其在細(xì)胞核中通過結(jié)合環(huán)化外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子促進(jìn)circRNA形成，在細(xì)胞質(zhì)中與成熟的circRNA相互作用[28]。病毒感染后，NF90/NF110迅速從與circRNA結(jié)合形成的circRNP中釋放出來，并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)出至胞質(zhì)，使細(xì)胞核內(nèi)NF90/NF110的表達(dá)顯著降低[28]。NF90/NF110可通過與病毒信使RNA結(jié)合而抑制病毒的增殖、復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒的免疫功能[28]。這些發(fā)現(xiàn)為circRNA與細(xì)胞免疫因子間的相互作用提供了重要線索，證實了circRNA在免疫調(diào)節(jié)和病毒感染中的作用，circRNA可用于增強(qiáng)免疫激活，也可用于抗病毒治療。然而，circRNA在抗病毒免疫中的作用尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究，以充分闡明circRNA與宿主免疫系統(tǒng)在抗病毒防御反應(yīng)中復(fù)雜的相互作用。繼續(xù)研究circRNA在抗病毒免疫中的作用，不僅可以提高對circRNA生理功能的認(rèn)識，而且可以為病毒性肺炎提供新的治療策略。

4 circRNA與肺部感染性疾病的關(guān)系

circRNA獨(dú)特的性質(zhì)和功能引起了研究者極大的興趣，circRNA的突變或異常表達(dá)在一系列疾病中起重要作用，其在腫瘤細(xì)胞中的作用研究最為成熟[29]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，circRNA的表達(dá)譜會隨著肺部感染性疾病的進(jìn)程而發(fā)生變化[2]，國內(nèi)外大量學(xué)者針對circRNA參與肺部感染性疾病的機(jī)制及靶向治療進(jìn)行了探索。

4.1肺結(jié)核 目前在肺部感染性疾病中，對circRNA與結(jié)核分枝桿菌感染研究得最多。宿主防御結(jié)核分枝桿菌感染需要啟動先天免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但circRNA是如何通過調(diào)控免疫應(yīng)答抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的尚需進(jìn)一步研究。目前關(guān)于結(jié)核分枝桿菌感染與circRNA的研究主要集中在生物標(biāo)志物上。Huang等[20]采用高通量測序技術(shù)檢測了結(jié)核分枝桿菌感染后人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞中circRNA的表達(dá)情況。該研究首次證明，人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞感染結(jié)核分枝桿菌后circRNA的表達(dá)發(fā)生了變化，并提出hsa_CIRC_0043497和hsa_CIRC_0001204是診斷結(jié)核病的有效生物標(biāo)志物。隨后Qian等[2]發(fā)現(xiàn)，在活動性肺結(jié)核患者中，多個通路內(nèi)circRNA的表達(dá)發(fā)生異常，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體、趨化因子信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路等，基于這些通路內(nèi)差異表達(dá)的circRNA，選擇肺結(jié)核患者中7條差異表達(dá)的circRNAs作為7-circRNAs肺結(jié)核分子標(biāo)志物，并在一個獨(dú)立隊列中(11例健康人和10例肺結(jié)核患者)驗證了7-circRNAs具有區(qū)分結(jié)核病患者與健康人的能力，且結(jié)核病患者與健康人的結(jié)核病指數(shù)的受試者工作特征曲線下面積為0.946(95%CI0.880～0.951，P<0.001)[20]。因此，7-circRNAs可作為診斷結(jié)核病的可靠的生物標(biāo)志物。此外，研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0005836和hsa_circ_0009128在活動性肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)也較正常對照組顯著下調(diào)，hsa_circ_0005836和hsa_circ_0009128也可能成為結(jié)核感染的一種新的潛在的生物標(biāo)志物[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，血漿hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024的表達(dá)水平與肺結(jié)核嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，hsa_circ_0001953與hsa_circ_0009024聯(lián)合診斷肺結(jié)核的受試者工作特征曲線下面積為0.915，治療后患者血漿hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024水平顯著降低(P<0.001)[30]。因此，hsa_circ_0001953和hsa_circ_0009024可以作為診斷肺結(jié)核的可靠的新型生物標(biāo)志物。以上研究證實，circRNA參與了結(jié)核病的病理過程，其可作為結(jié)核病感染的候選生物標(biāo)志物，為結(jié)核病的診斷開辟了新的方向。

除作為生物標(biāo)志物外，還有研究探討了circRNA在肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3]。幾種途徑包括腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞途徑、促分裂原活化的蛋白激酶信號通路、人類T細(xì)胞白血病1型病毒感染以及泛素介導(dǎo)的蛋白水解信號通路等可能在結(jié)核的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[3]。其中，促分裂原活化的蛋白激酶信號通路通過增強(qiáng)抗結(jié)核分枝桿菌的活性以及產(chǎn)生腫瘤壞死因子α、IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子來防御結(jié)核分枝桿菌感染[31]，因此circRNA可能通過促分裂原活化的蛋白激酶信號通路參與調(diào)控結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展。該研究還預(yù)測，circRNA可能充當(dāng)miRNA海綿調(diào)控結(jié)核感染，并構(gòu)建了circRNA-miRNA-信使RNA網(wǎng)絡(luò)圖，為未來進(jìn)一步研究circRNA抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的分子機(jī)制提供有用信息[31]。

4.2急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) 有學(xué)者探索了內(nèi)毒素感染后circRNA的表達(dá)情況。在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠ARDS模型中，分別有395條和562條circRNA顯著上調(diào)和下調(diào)[32]。研究證實4條上調(diào)的circRNA(mmu_circRNA_19423、rno_circRNA_010489、rno_circRNA_011426、mmu_circRNA_30664)和1條下調(diào)的circRNA(rno_circRNA_005564)與表達(dá)譜的差異趨勢一致，在rno_circRNA_010489的靶miRNA中，miR-34c-5在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中顯著下調(diào)[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34c-5p的表達(dá)在小鼠流感肺炎模型中下調(diào)[34]。因此，可以假設(shè)rno_circRNA_010489可作為miRNA的海綿在ARDS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用。

盡管許多關(guān)于ARDS的研究都集中在發(fā)病機(jī)制和治療的潛在目標(biāo)上，包括miRNA對ARDS的影響，但是circRNA在ARDS發(fā)病機(jī)制中的作用及其對ARDS發(fā)病機(jī)制的總體貢獻(xiàn)仍然未知。目前的研究結(jié)果還是初步的，需要進(jìn)一步精心設(shè)計大樣本的縱向研究，以證實circRNA是ARDS潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

4.3病毒性肺炎 兒童病毒性肺炎常由呼吸道合胞病毒感染導(dǎo)致，其他如腺病毒、單純皰疹病毒、副流感病毒、巨細(xì)胞病毒、鼻病毒以及柯薩奇病毒等也可引起病毒性肺炎。有學(xué)者研究了單純皰疹病毒1(herpes simplex virus-1，HSV-1)感染人胚肺成纖維細(xì)胞后circRNA的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量病毒反應(yīng)性circRNAs，并預(yù)測其在circRNA-miRNA-信使RNA調(diào)控軸中的潛在機(jī)制[35]。盡管對circRNA、miRNA和信使RNA的綜合分析預(yù)測了circRNA的潛在作用，但是circRNA在HSV-1感染中的具體作用尚未通過實驗驗證。因此，未來的研究應(yīng)集中在circRNA在HSV-1感染病因?qū)W中的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。

有研究提示，miRNA在呼吸道合胞病毒、腺病毒感染后差異表達(dá)[36-37]。miRNA在呼吸道合胞病毒感染的嬰兒的外周血和呼吸道上皮中異常表達(dá)，并參與了免疫細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)[36]。同樣，在腺病毒感染的兒童中，全血miRNA顯著差異表達(dá)，并參與了促分裂原活化的蛋白激酶信號通路和先天免疫反應(yīng)[37]。因此未來需要證實，circRNA作為miRNA的海綿是否參與調(diào)節(jié)這些病毒的感染，是否可作為病毒性肺炎診斷的標(biāo)志物。

5 小 結(jié)

circRNA是具有高度穩(wěn)定性、物種保守性以及細(xì)胞、組織特異性的非編碼RNA，與其他RNA類型相比，這些特性使circRNA有可能被用作更理想的生物標(biāo)志物和更合適的潛在治療靶點(diǎn)。circRNA不僅在免疫細(xì)胞中豐富表達(dá)，還在感染及免疫調(diào)節(jié)中扮演著舉足輕重的作用，可通過與miRNA相互作用參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化作用，也可以誘導(dǎo)先天免疫基因表達(dá)，從而保護(hù)宿主免受病毒感染。circRNA作用機(jī)制錯綜復(fù)雜，其究竟通過何種方式調(diào)控肺部感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展還有待深入，以期為今后感染性疾病的預(yù)防、診斷及治療提供新的思路和應(yīng)對策略。