乳腺癌DNA甲基化臨床研究進(jìn)展

華艷珊，奎 翔，易曉佳，王 燕

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，昆明 650000)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。以往研究認(rèn)為，基因突變、缺失等導(dǎo)致DNA序列改變而使癌基因激活、抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制[2]。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)DNA序列以外的調(diào)控機(jī)制異常，即表觀遺傳學(xué)變化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，研究認(rèn)為是由遺傳和表觀遺傳變異積累的結(jié)果[4]。在乳腺癌中，由于基因組事件少于其他癌癥，表觀遺傳修飾被認(rèn)為在非遺傳性乳腺癌中更為重要[5]。因此，研究乳腺癌進(jìn)展中的表觀遺傳機(jī)制以鑒定臨床適用的生物學(xué)標(biāo)志物是合理而有價(jià)值的。

DNA甲基化修飾是表觀遺傳學(xué)中常見(jiàn)且重要的一種表現(xiàn)形式，在諸多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。乳腺癌中基因甲基化頻率的異常并不少見(jiàn)，涉及的基因種類也極為廣泛，其中包括細(xì)胞周期調(diào)控基因(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A、p14ARF)、DNA修復(fù)基因(O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、人類mutL同源物1基因)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(視黃酸受體β2基因、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因)及細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移基因(鈣黏蛋白1、鈣黏蛋白13)等[6]?；虻漠惓＜谆淖兪侨橄侔┲衅毡榇嬖诘姆肿邮录?，這種異常的DNA甲基化狀態(tài)可能成為乳腺癌診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，且DNA甲基化修飾過(guò)程早于蛋白質(zhì)翻譯，相較于檢測(cè)癌癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平，在乳腺癌早期診斷中可能具有更大的價(jià)值?，F(xiàn)就DNA甲基化在乳腺癌患者早期診斷、相關(guān)臨床病理特征、預(yù)后及治療中的臨床意義予以綜述。

1 表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化

表觀遺傳學(xué)變化是指并不涉及遺傳序列變化的特征性遺傳改變，涉及的分子機(jī)制主要包括DNA甲基化修飾、組蛋白修飾(乙酰化、磷酸化、甲基化等)或蛋白質(zhì)構(gòu)象改變、染色質(zhì)重塑、X染色體失活以及非編碼RNA[7]。其中DNA甲基化是表觀遺傳改變的主要形式，DNA甲基化是指核酸序列中胞嘧啶在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，被修飾為5-甲基胞嘧啶的過(guò)程，其甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸。DNA甲基化發(fā)生于CpG序列，C、G兩種核苷酸高度聚集形成CpG島，主要位于基因的啟動(dòng)子區(qū)和第一個(gè)外顯子區(qū)域。CpG島的高甲基化促進(jìn)染色質(zhì)形成致密結(jié)構(gòu)，不利于基因的表達(dá)。在正常組織中，70%～90%的散在CpG是被甲基化修飾的，而CpG島則是非甲基化的[8]。甲基化修飾是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，基因組DNA甲基化的異常改變可以通過(guò)影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)，導(dǎo)致基因功能改變和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，最終形成腫瘤。

2 DNA甲基化檢測(cè)與乳腺癌早期診斷

流行病學(xué)研究顯示，早期診斷比治療更有利于改善乳腺癌患者的生存率[9]，通過(guò)乳腺鉬靶檢查早期診斷乳腺癌能夠有效降低30%的病死率[10]。然而，盡管乳腺鉬靶及其他影像學(xué)檢查手段診斷乳腺癌有較高的特異性和敏感性，并已成為一種較為有效的乳腺癌篩查和診斷方式，但射線輻射、主觀判斷以及對(duì)于檢測(cè)年輕女性乳腺增生缺乏敏感度等因素導(dǎo)致這種方法也存在一定的局限性[11]。乳腺鉬靶檢查的假陽(yáng)性結(jié)果可能帶來(lái)過(guò)度診斷和過(guò)度治療，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更快地?cái)U(kuò)散[12]。因此，有必要開(kāi)發(fā)更加準(zhǔn)確、高效的分子標(biāo)志物來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的診斷效率。

研究證實(shí)[13]有大量的基因呈現(xiàn)出癌癥特異性的甲基化改變，且在乳腺癌患者中有較高的發(fā)生比例，同時(shí)通過(guò)DNA甲基化檢測(cè)診斷乳腺癌的相關(guān)系列研究均顯示出較高的診斷特異性和敏感性，是有望成為早期診斷乳腺癌的重要分子標(biāo)志物。人類Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Runt-related transcription factor 3，RUNX3)基因是一個(gè)抑癌基因，在乳腺癌等多種腫瘤中被抑制失活，該基因的高甲基化是使其失活的重要機(jī)制之一[14]。Lu等[15]對(duì)RUNX3基因高甲基化在乳腺癌中的臨床病理學(xué)意義進(jìn)行了一項(xiàng)Meta分析，對(duì)747例乳腺癌病例的數(shù)據(jù)資料分析顯示，RUNX3高甲基化與乳腺導(dǎo)管原位癌和導(dǎo)管浸潤(rùn)癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，與雌激素受體陰性乳腺癌病例相比，RUNX3甲基化率在乳腺癌雌激素受體陽(yáng)性病例中顯著升高，并且RUNX3基因信使RNA高表達(dá)與無(wú)瘤生存期延長(zhǎng)顯著相關(guān)，提示RUNX3基因高甲基化與乳腺癌臨床病理分型及生存預(yù)后存在重要聯(lián)系，作為乳腺癌早期診斷分子標(biāo)志物有較大的應(yīng)用前景。另有研究顯示，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因[16]、乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)[17]和腺瘤性結(jié)腸息肉病基因[17-18]等基因在乳腺癌患者中同樣發(fā)生了較高比例的甲基化改變，可以作為乳腺癌早期診斷的候選標(biāo)志分子。

值得注意的是，個(gè)別基因甲基化雖然表現(xiàn)出良好的乳腺癌特異性，但單獨(dú)用于診斷乳腺癌往往敏感性較差，因此需要聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)基因甲基化位點(diǎn)改變，構(gòu)建詳細(xì)的甲基化聯(lián)合圖譜，以此作為早期診斷乳腺癌的診斷標(biāo)記。Brooks等[6]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合Ras相關(guān)區(qū)域家族1A、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1、視黃酸受體β2基因和腺瘤性結(jié)腸息肉病基因甲基化檢測(cè)可以顯著改善乳腺癌的診斷效率。Shan等[19]進(jìn)行的一系列研究同樣證實(shí)了這一點(diǎn)，他們通過(guò)采集乳腺癌、乳腺良性結(jié)節(jié)和健康人群3組血清樣本，聯(lián)合檢測(cè)人分層蛋白、p16、人類mutL同源物1基因、同源框D13基因、原鈣黏蛋白B亞族7和Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化改變，結(jié)果顯示，與良性結(jié)節(jié)組、健康人群組相比，乳腺癌組診斷乳腺癌的靈敏度分別為82.4%、79.6%，特異度分別為78.1%、72.4%，相較檢測(cè)單個(gè)基因可明顯提高診斷的敏感性和特異性，提示多個(gè)基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)更具有臨床應(yīng)用潛力，這可能是未來(lái)甲基化檢測(cè)用于癌癥診斷的發(fā)展方向。

3 DNA甲基化與乳腺癌臨床病理特征

研究顯示，DNA甲基化與乳腺癌臨床病理特征之間確實(shí)存在顯著關(guān)聯(lián)[20]。An等[21]對(duì)乳腺癌患者O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶高甲基化與雌激素受體陰性表達(dá)、絕經(jīng)及臨床病理學(xué)Ⅲ級(jí)分期相關(guān)。He等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腺瘤性結(jié)腸息肉病基因啟動(dòng)子甲基化與癌癥分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和雌激素受體表達(dá)情況均相關(guān)(在分期較高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)升高，雌激素受體陽(yáng)性表達(dá)時(shí)降低)。Callahan等[22]評(píng)估了720例乳腺癌病例的腫瘤樣本中9種基因分泌球蛋白家族3A成員1、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1、視黃酸受體β2基因、脾相關(guān)酪氨酸激酶、脆性組氨酸三聯(lián)體基因、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A、細(xì)胞周期蛋白D2、BRCA1和人分層蛋白甲基化與腫瘤臨床病理特征和生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)雌激素受體和孕激素受體陽(yáng)性與分泌球蛋白家族3A成員1高甲基化相關(guān)；在絕經(jīng)前婦女中，與0期患者相比，侵襲性癌患者更可能具有視黃酸受體β2基因高甲基化，脆性組氨酸三聯(lián)體基因則具有更低甲基化；在絕經(jīng)后婦女中，脾相關(guān)酪氨酸激酶的甲基化與腫瘤大小增加和更高的核級(jí)相關(guān)；BRCA1和分泌球蛋白家族3A成員1高甲基化與乳腺癌死亡風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，細(xì)胞周期蛋白D2甲基化則與乳腺癌死亡風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。與腫瘤臨床病理特征相關(guān)的甲基化差異體現(xiàn)了DNA甲基化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性，檢測(cè)這些基因甲基化可能會(huì)對(duì)預(yù)防和治療產(chǎn)生重要影響。

DNA異常甲基化在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中能夠沉默抑癌基因表達(dá)，同時(shí)導(dǎo)致原癌基因激活，并可通過(guò)下游信號(hào)通路參與不同類型乳腺癌臨床病理特征的形成，特別是激素受體表達(dá)狀態(tài)。這可能部分解釋特定基因甲基化與乳腺癌臨床病理特征存在顯著相關(guān)性的原因，但產(chǎn)生這一關(guān)聯(lián)性的具體機(jī)制還需更進(jìn)一步研究。目前研究結(jié)果也只反映出特定基因與一部分臨床病理特征相關(guān)，且限于多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究樣本量較小，DNA甲基化檢測(cè)方法各異等因素，所得出的研究結(jié)果還存在一定爭(zhēng)議，尚無(wú)一致性結(jié)論。

4 DNA甲基化檢測(cè)與乳腺癌預(yù)后評(píng)估

在常規(guī)臨床實(shí)踐中，部分臨床病理特征被用于評(píng)估乳腺癌患者可能預(yù)后，如腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[23]。其次，乳腺癌不同分子亞型也提示不同的預(yù)后情況。研究表明，與其他分子亞型相比，三陰性乳腺癌往往腫瘤級(jí)別較高，有更高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且相對(duì)缺乏有效的治療方法，導(dǎo)致無(wú)瘤生存和總體存活率較低[24]。對(duì)于腫瘤患者而言，一經(jīng)確診，對(duì)其進(jìn)行盡可能準(zhǔn)確的生存預(yù)后評(píng)估，直接影響患者的后續(xù)治療及治療依從性。因而，探尋新的預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)也是腫瘤研究的重點(diǎn)內(nèi)容，而DNA甲基化在乳腺癌預(yù)后評(píng)估中同樣也能夠發(fā)揮一定作用。

研究顯示，在乳腺腫瘤或乳腺癌細(xì)胞系中已有超過(guò)100個(gè)基因被鑒定出現(xiàn)異常甲基化[25]，且DNA甲基化與乳腺癌臨床病理特征存在顯著相關(guān)性，而乳腺癌臨床病理特征又與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示DNA甲基化可能成為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，有望成為輔助現(xiàn)有預(yù)測(cè)指標(biāo)的有力工具。

Sheng等[26]進(jìn)行的一項(xiàng)Meta分析評(píng)估了乳腺癌中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1、p16、雌激素受體1和垂體同源盒2啟動(dòng)子甲基化對(duì)患者預(yù)后的影響，在大樣本患者群體中，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1在總生存率中呈現(xiàn)出更差的預(yù)后趨勢(shì)，垂體同源盒2啟動(dòng)子甲基化與總生存率預(yù)后差和無(wú)轉(zhuǎn)移生存期短的不良預(yù)后顯著相關(guān)，雌激素受體11啟動(dòng)子甲基化與總生存率預(yù)后較差相關(guān)，異常甲基化的雌激素受體11、垂體同源盒2和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1的臨床應(yīng)用可能是乳腺癌預(yù)后的一個(gè)有前途的檢測(cè)指標(biāo)。Minatani等[27]研究了172例原發(fā)性乳腺癌組織中半胱氨酸雙加氧酶1(cysteine dioxygenase 1，CDO1)基因的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，在原發(fā)性乳腺癌患者中顯示出CDO1基因啟動(dòng)子甲基化與不良預(yù)后的強(qiáng)相關(guān)性，尤其是三陰性乳腺癌，CDO1基因甲基化狀態(tài)被認(rèn)為是原發(fā)性乳腺癌的理想預(yù)后指標(biāo)。Dietrich等[28]證明原發(fā)性乳腺癌中CDO1基因的啟動(dòng)子甲基化過(guò)度，并可能是原發(fā)性乳腺癌患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)因子。Jeschke等[29]證明CDO1基因的啟動(dòng)子DNA甲基化與腫瘤進(jìn)展顯著相關(guān)，且在用蒽環(huán)類藥物治療的原發(fā)性乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)預(yù)后相關(guān)性。因此，基因的異常啟動(dòng)子甲基化可提供更獨(dú)立的預(yù)后信息作為乳腺癌治療和管理中的預(yù)后指標(biāo)。

5 DNA甲基化與乳腺癌治療新靶標(biāo)

新的生物學(xué)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的診斷創(chuàng)新和個(gè)性化醫(yī)療至關(guān)重要[30]。由于DNA甲基化改變?cè)谌橄侔┌l(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用，以去甲基化恢復(fù)特定基因活性是腫瘤預(yù)防和治療的一種有效手段，目前研究最多的是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。第1個(gè)表型修飾藥物為5-氮雜胞苷及其類似物5-氮雜-2′-脫氧胞苷，它通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性以逆轉(zhuǎn)異常的DNA甲基化，2006年已被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)[31]用于白血病前骨髓增生異常綜合征的治療。目前正在進(jìn)行5-氟-2′-脫氧胞苷的臨床試驗(yàn)用于治療乳腺癌和其他實(shí)體瘤[32]。但臨床應(yīng)用該類藥物也存在不可忽視的不良反應(yīng)，一方面，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑特異性不強(qiáng)，不能針對(duì)某一特定抑癌基因進(jìn)行靶向治療，在去除異常甲基化的同時(shí)也可能干擾正常基因甲基化；另一方面，研究顯示高劑量的5-氮雜-2′-脫氧胞苷可能誘發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移播散，因此該類藥物在臨床上的應(yīng)用受到很大限制，研究開(kāi)發(fā)靶向去甲基化藥物可能顯著降低不良反應(yīng)，達(dá)到更好的治療效果。

DNA甲基化除能為乳腺癌患者開(kāi)發(fā)新的治療策略外，某些特定基因的甲基化狀態(tài)還可能影響治療決策。BRCA1基因低表達(dá)(BRCAness)乳腺癌代表以BRCA1基因表達(dá)減少為特征的一組散發(fā)性腫瘤。由于BRCA1參與雙鏈斷裂修復(fù)，功能失調(diào)的BRCA途徑可能使腫瘤對(duì)DNA損傷藥物(如順鉑)和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶抑制劑療法敏感[33]。因此，準(zhǔn)確鑒定BRCAness腫瘤有助于臨床醫(yī)師進(jìn)行治療決策。Branham等[34]研究發(fā)現(xiàn)，BRCAness腫瘤的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子是人類mutL同源物1基因和成對(duì)框5基因的甲基化以及細(xì)胞周期蛋白D2和DNA結(jié)合抑制因子4的非甲基化，檢測(cè)這些基因的甲基化狀態(tài)對(duì)于診斷BRCAness腫瘤具有一定的指示作用。該研究表明，基因甲基化狀態(tài)的改變也能作為鑒定BRCAness乳腺癌的分子標(biāo)志，而不再僅僅關(guān)注BRCA的突變狀態(tài)。

臨床上針對(duì)曲妥珠單抗的抗性發(fā)展導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)仍是針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2陽(yáng)性乳腺癌治療的主要障礙。Palomeras等[35]發(fā)現(xiàn)，耐曲妥珠單抗SKTR細(xì)胞和曲妥珠單抗敏感的SKBR3細(xì)胞中甲基化狀態(tài)不同，在SKTR細(xì)胞中4種高甲基化基因包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、Bcl-6、p53調(diào)控DNA復(fù)制抑制因子和組織蛋白酶Z通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)分析顯示表達(dá)下調(diào)，用脫甲基劑處理SKTR細(xì)胞可重新獲得所有4種基因的表達(dá)，且這些基因恢復(fù)的表達(dá)水平與SKBR3細(xì)胞的表達(dá)水平一致。因此，高甲基化基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2、Bcl-6、p53調(diào)控DNA復(fù)制抑制因子和組織蛋白酶Z在人表皮生長(zhǎng)因子受體2陽(yáng)性乳腺癌患者中可能作為曲妥珠單抗耐藥的預(yù)測(cè)性分子指標(biāo)。DNA甲基化與藥物耐藥的研究有望發(fā)現(xiàn)更多類似的耐藥預(yù)測(cè)性生物標(biāo)簽，脫甲基化處理可能一定程度恢復(fù)乳腺癌患者對(duì)化療藥物的敏感性。

6 結(jié) 語(yǔ)

DNA甲基化與乳腺癌臨床病理特征、預(yù)后顯著相關(guān)，在乳腺腫瘤發(fā)展中選擇特定的DNA甲基化標(biāo)記可能會(huì)促進(jìn)乳腺癌早期診斷和臨床管理新方法的發(fā)展。但要鑒定可靠的甲基化生物標(biāo)簽仍需更多大樣本的實(shí)驗(yàn)研究提供支持，同時(shí)需要更加精確的甲基化檢測(cè)技術(shù)保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。目前，已有多個(gè)基因展現(xiàn)出很好的實(shí)驗(yàn)效果，并有望應(yīng)用于乳腺癌臨床診療。同時(shí)，甲基化檢測(cè)技術(shù)方法正在不斷更新和進(jìn)步?？傊橄侔〥NA甲基化的臨床研究已展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。