線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

顏思陽，陳 瑤，周德生，郭 純，劉利娟※

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.神經(jīng)內(nèi)科，b.中心實(shí)驗(yàn)室，長沙 410007)

腦卒中已成為世界上致死和致殘的第二大原因[1-2]，其以突然發(fā)病的神經(jīng)功能缺損為特征。而缺血性腦卒中約占全部卒中的69.6%，占腦卒中發(fā)病率的第一位，也是腦卒中死亡的首要原因[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，缺血性腦卒中的發(fā)病率為91.3/10萬～263.1/10萬，年平均發(fā)病率為145.5/10萬，復(fù)發(fā)率為8.47%[4]。目前，急性腦梗死的治療[5]包括靜脈內(nèi)使用重組組織型纖溶酶原激活劑、血管內(nèi)機(jī)械取栓等，其治療目標(biāo)均為使缺血的腦組織恢復(fù)血液供應(yīng)，臨床亦稱之為再灌注。然而，雖然缺血腦組織氧氣供應(yīng)的恢復(fù)有一定益處，但快速再灌注對(duì)腦功能可產(chǎn)生有害作用，即再灌注損傷。因此，腦梗死的理想治療策略是恢復(fù)缺血組織的氧氣供應(yīng)，同時(shí)盡量減少再灌注損傷。作為缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵靶區(qū)，線粒體與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切，其功能紊亂是腦缺血再灌注中細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。腦缺血損傷中受損的線粒體可通過自噬活動(dòng)被選擇性清除[6]。但研究證實(shí)，線粒體自噬是一把雙刃劍，即適當(dāng)?shù)木€粒體自噬有助于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，而線粒體自噬失調(diào)或過度可能是有害的[7]。現(xiàn)就線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 線粒體自噬

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵細(xì)胞器，被譽(yù)為細(xì)胞的動(dòng)力工廠。除能為細(xì)胞提供能量外，其還參與了多種重要細(xì)胞活動(dòng)。Lemasters[8]于2005年首次提出線粒體自噬這一概念，其指細(xì)胞為維持正常生理過程，進(jìn)化產(chǎn)生的一種利用自噬活動(dòng)選擇性清除損傷線粒體的機(jī)制，這一機(jī)制可能具有減少由衰老引起的線粒體DNA突變的作用。線粒體自噬可以控制線粒體的數(shù)量使之與新陳代謝的需求相匹配，同時(shí)也是一種對(duì)受損線粒體的清除和控制手段。

1.1線粒體自噬相關(guān)蛋白 研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注過程中線粒體自噬受多種蛋白的調(diào)節(jié)，包括第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物誘導(dǎo)的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)、Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B-19 kDa-interacting protein 3,BNIP3)等[9-11]。而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，存在兩種與線粒體自噬調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即PINK1/Parkin依賴途徑[12]和PINK1/Parkin非依賴途徑[13]。其中在不依賴PINK1/Parkin的線粒體自噬中，BH3-only促凋亡蛋白、BNIP3和FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1尤為重要[14-16]。線粒體自噬相關(guān)蛋白在線粒體自噬途徑中作用于不同的節(jié)點(diǎn)，或單獨(dú)或互相作用，在一定程度上調(diào)控自噬的發(fā)生。

1.2線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控的線粒體自噬 線粒體動(dòng)力學(xué)在調(diào)控線粒體自噬時(shí)發(fā)揮了重要作用。為維持其功能的完整性，線粒體參與了多種動(dòng)態(tài)活動(dòng)，如生物的發(fā)生、融合、裂變、轉(zhuǎn)運(yùn)和自噬。同時(shí)，細(xì)胞的能量狀態(tài)與特定的線粒體形態(tài)相關(guān)。線粒體動(dòng)力學(xué)(融合/裂變)和線粒體自噬是維持線粒體功能和能量穩(wěn)態(tài)的兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞過程[17-19]。它們的適當(dāng)調(diào)節(jié)有助于細(xì)胞存活；相反，兩者不平衡將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體分裂是腦缺血后早期神經(jīng)元死亡的上游事件[20-22]。有研究證明，短暫的全腦缺血會(huì)誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)線粒體的動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)短暫增加[23]。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)化了線粒體動(dòng)力學(xué)在缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中的重要作用。除分裂和融合外，線粒體膜電位在線粒體自噬中也扮演了重要角色。研究證明，PINK1和Parkin能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞的線粒體自噬，且更傾向于介導(dǎo)去極化線粒體的清除[24]。當(dāng)PINK1識(shí)別受損的線粒體時(shí)，它可以穩(wěn)定地積聚在線粒體外膜表面充當(dāng)生物傳感器[25]。其激酶活性和結(jié)構(gòu)的完整性是誘導(dǎo)Parkin易位至受損線粒體，進(jìn)而激活線粒體自噬的主要條件。此外，PINK1和Parkin的平衡和相對(duì)活性也決定了線粒體膜電位的重建和電子傳遞酶的效率，以避免線粒體自噬過度而造成健康的線粒體損傷[26-27]。另有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA損傷、線粒體毒性、線粒體蛋白修飾和病毒性感染均會(huì)激活線粒體自噬[28]。

2 線粒體自噬與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷是一極為復(fù)雜的病理生理過程，呈快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過氧化、氧自由基損傷、凋亡基因激活、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性作用、炎性細(xì)胞因子損害等[29-31]。這些病理反應(yīng)引起的線粒體功能紊亂、炎性損傷及細(xì)胞損傷等多種機(jī)制在腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中扮演不同角色。研究表明，腦缺血再灌注中線粒體損傷及功能紊亂是造成神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因[6]。線粒體自噬作為一種清除受損線粒體的途徑，在腦缺血再灌注中起重要作用，但目前尚有爭議。自噬可以在缺血預(yù)處理中起保護(hù)作用，但一旦發(fā)生缺血再灌注損傷就會(huì)產(chǎn)生不同的作用[32-33]。在缺血再灌注14 d后線粒體自噬受到抑制，而復(fù)方腦肽節(jié)苷脂注射液能通過激活線粒體自噬改善腦缺血再灌注損傷[34]。腦卒中后的一些病理生理反應(yīng)，如重度高血糖可通過抑制線粒體自噬的激活，阻礙急性缺血早期內(nèi)源性受損線粒體的清除，致使受損線粒體發(fā)生堆積，進(jìn)而擴(kuò)大線粒體介導(dǎo)的下游凋亡損傷，加重大鼠的腦梗死損傷程度[35]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后BNIP3的表達(dá)增加，其造成線粒體自噬過度激活，引發(fā)遲發(fā)性細(xì)胞死亡，加重腦缺血再灌注損傷[36]。另有研究發(fā)現(xiàn)，缺血后6 h尾靜脈注射肌肽能通過抑制自噬和線粒體自噬的激活，來達(dá)到抑制自噬性細(xì)胞死亡和保護(hù)缺血再灌注損傷的目的[37]。雖然線粒體自噬作在腦缺血再灌注損傷中所起的作用一直存在爭議，但能夠確定的是受損線粒體的過度清除和清除不足均將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[38]。

2.1能量代謝障礙 線粒體通過氧化磷酸化為大多數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生ATP，在生理?xiàng)l件下通過復(fù)合物Ⅰ～Ⅴ產(chǎn)生超過95%的細(xì)胞能量[39]。在幾乎所有的腦卒中動(dòng)物模型中，氧化代謝均受到葡萄糖和氧缺乏的影響，這會(huì)迅速改變ATP和其他主要與線粒體有關(guān)的能量相關(guān)代謝物[40]。在線粒體基質(zhì)中，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等均與能量代謝相關(guān)[41]。在腦缺血再灌注中，線粒體的能量代謝可通過各種機(jī)制改變。在病理?xiàng)l件下，缺血半暗帶中的大多數(shù)細(xì)胞在缺血2 h后仍然存活，而葡萄糖和ATP水平顯著降低，且磷酸肌酸水平降低至非缺血時(shí)的約70%[42]。相反，缺血時(shí)無氧糖酵解間接增加并產(chǎn)生大量乳酸，使細(xì)胞內(nèi)pH降低，導(dǎo)致多種細(xì)胞內(nèi)酶的活性降低或喪失[43]。此外，葡萄糖代謝的減少可導(dǎo)致丙酮酸氧化增加[44]，影響乙酰輔酶A的活化，并引起三羧酸循環(huán)的持續(xù)激活[45]，導(dǎo)致線粒體能量代謝異常。而再灌注能部分地恢復(fù)腦內(nèi)血流，并將葡萄糖利用率降低到缺血核心的正常范圍的一半左右[46-47]。同時(shí)，它還使ATP的水平較磷酸肌酸或腺苷酸能量電荷恢復(fù)得更慢。

2.2氧化應(yīng)激過度激活 維持線粒體功能的正常對(duì)細(xì)胞功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。對(duì)于由高能量需求的神經(jīng)元細(xì)胞，氧化磷酸化過程極為重要。但是，線粒體的氧化磷酸化過程會(huì)伴隨活性氧類的產(chǎn)生。正常情況下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的適量活性氧類可作為信號(hào)分子參與細(xì)胞生長發(fā)育、免疫等[48]。但當(dāng)發(fā)生腦缺血后，腦血流的急劇減少導(dǎo)致氧糖缺乏，從而引起線粒體結(jié)構(gòu)異常，氧化磷酸化發(fā)生障礙。在再灌注期間，由恢復(fù)氧供引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)再灌注損傷的核心環(huán)節(jié)，而線粒體是其關(guān)鍵[49]。腦缺血再灌注后，興奮性氨基酸損傷、低氧、鈣超載等多種因素作用引起線粒體氧化磷酸化障礙，活性氧類生成增多，清除能力下降，導(dǎo)致活性氧類大量積累引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步加重了線粒體損傷[50]。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道了氧化應(yīng)激及線粒體自噬在維護(hù)機(jī)體穩(wěn)態(tài)中的作用，其中雷帕霉素滅活介導(dǎo)的線粒體自噬，可通過修復(fù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自溶酶體/溶酶體功能障礙延緩線粒體的衰老[51]。此外，活性氧類可通過激活PINK1/Parkin通路誘導(dǎo)線粒體發(fā)生自噬，清除受損及多余線粒體以維護(hù)線粒體健康[52]?？梢?，機(jī)體氧化應(yīng)激與線粒體自噬的調(diào)節(jié)是相互的，其在一定程度上起保護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。

2.3線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 研究發(fā)現(xiàn)，缺血后腦組織線粒體內(nèi)雖然有一定的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，但并不能逆轉(zhuǎn)持續(xù)性損傷[49]。而一些藥物，如雷帕霉素[32]、復(fù)方腦肽節(jié)苷脂[34]等可通過影響線粒體膜電位及線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)線粒體自噬，提高神經(jīng)細(xì)胞在腦缺血后的存活率，并在一定程度上改善神經(jīng)功能，對(duì)腦缺血再灌注造成的腦組織損傷起保護(hù)作用。

2.3.1PINK1和Parkin PINK1/Parkin通路調(diào)控的線粒體自噬最為典型。其中，PINK1在腦內(nèi)高度表達(dá)，能作為受損傷線粒體的分子感受器；Parkin主要介導(dǎo)底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。PINK1和Parkin廣泛表達(dá)于各組織和器官，尤以腦、心肌、骨骼肌等高耗能器官中含量豐富，可作為線粒體受損時(shí)的第一道防線。目前有證據(jù)表明，PINK1和Parkin參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程。氧糖剝奪/復(fù)氧可激活PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬，并在其病理生理過程中發(fā)揮作用[53]。而PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬可能受多種條件影響，如活性氧類可通過激活PINK1/Parkin通路誘導(dǎo)線粒體發(fā)生自噬。除線粒體自噬途徑外，Parkin和Pink1還可通過其他幾種機(jī)制影響線粒體的質(zhì)量控制[54]，如PINK1和Parkin通過PINK1介導(dǎo)的磷酸化和Parkin介導(dǎo)的蛋白酶體降解線粒體銜接蛋白(Miro)影響線粒體運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)線粒體自噬去除受損的線粒體[55]。此外，Parkin通過蛋白酶體降解鋅指蛋白正向調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α的轉(zhuǎn)錄[56]。以上研究表明，Parkin以不同方式參與線粒體質(zhì)量控制和代謝的調(diào)控。

2.3.2BNIP3和Nix 腦缺血再灌注損傷的首發(fā)事件，是腦血流中斷造成的腦組織缺血缺氧。BNIP3是低氧誘導(dǎo)因子1的靶基因，其啟動(dòng)子序列中含有低氧反應(yīng)元件，低氧時(shí)能被低氧誘導(dǎo)因子1轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)BNIP3表達(dá)上調(diào)。同樣，Nix啟動(dòng)子中也含有低氧反應(yīng)元件，其可被低氧誘導(dǎo)因子1轉(zhuǎn)錄激活。在體外和體內(nèi)研究中，有學(xué)者通過模擬腦缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子1α不僅可抑制腦細(xì)胞凋亡，還能增加細(xì)胞自噬，提示低氧誘導(dǎo)因子1α可能通過BNIP3和Nix途徑改善腦缺血再灌注后的腦損傷，并可能對(duì)腦缺血再灌注后的腦功能持續(xù)產(chǎn)生有益作用[57]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3相互作用所致的過度線粒體自噬可引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，且Nix主要調(diào)節(jié)生理?xiàng)l件下基線水平的線粒體自噬，而BNIP3僅激活過度的線粒體自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡[36]。此外，BNIP3可獨(dú)立調(diào)節(jié)線粒體誘導(dǎo)和細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的活性；為激活線粒體自噬，BNIP3作為系鏈發(fā)揮作用，將位于受損線粒體上的BNIP3連接到新生自噬體上存在的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ[58]。同時(shí)，BNIP3還可以增加線粒體發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1的定位，從而刺激線粒體網(wǎng)絡(luò)的碎裂，促進(jìn)受損線粒體的吞噬[59]。

2.3.3FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1 據(jù)報(bào)道，含有FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1的FUN14結(jié)構(gòu)域在線粒體自噬中發(fā)揮重要作用，特別是在缺氧條件下[60]，但不限于缺氧條件[61]。FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1含有與微管相關(guān)蛋白1輕鏈相互作用的經(jīng)典區(qū)域，可直接與微管相關(guān)蛋白1輕鏈或自噬相關(guān)蛋白8結(jié)合，誘導(dǎo)隨后的線粒體自噬。而敲除FUN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1基序可抑制線粒體自噬。此外，F(xiàn)UN14結(jié)構(gòu)域包含蛋白1還通過與Drp1和視神經(jīng)萎縮蛋白1[62]或鈣聯(lián)蛋白和Drp1的相互作用參與線粒體動(dòng)力學(xué)調(diào)控[63]。

2.3.4線粒體融合分裂相關(guān)蛋白 缺血性腦卒中急性期的治療目標(biāo)是挽救缺血性半暗帶，縮小缺血梗死灶的范圍并改善神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后，腦組織線粒體分裂和融合相關(guān)蛋白Drp1及視神經(jīng)萎縮蛋白1的表達(dá)水平出現(xiàn)失衡[64-66]。過度的線粒體分裂可導(dǎo)致線粒體斷裂是線粒體自噬過程中導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵步驟。已有研究證明，短暫的全腦缺血會(huì)誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)Drp1的短暫增加[23]。而關(guān)于Drp1在腦缺血再灌注損傷中的作用說法不一，有研究發(fā)現(xiàn)線粒體分裂抑制劑Mdivi-1的干擾可以加重原代皮層神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧損傷，其機(jī)制可能與它抑制Drp1向線粒體的遷移有關(guān)，通過抑制Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂，來抑制自噬和線粒體自噬的發(fā)生，從而加重缺血再灌注損傷[67]。另有研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物(塞絡(luò)通膠囊、肌肽等)在腦缺血損傷早期可能通過抑制缺血再灌注后Drp1的升高，來抑制線粒體分裂異常，進(jìn)而恢復(fù)線粒體的形態(tài)，維持其正常功能，從而減輕腦缺血再灌注損傷[32,68]。

2.3.5Beclin1 Beclin1是自噬的調(diào)節(jié)蛋白，且也參與了線粒體自噬。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后，Beclin1在大腦不同部位的表達(dá)水平隨缺血進(jìn)程的發(fā)展出現(xiàn)升高或降低的復(fù)雜變化[69]。此外有研究表明，Beclin1不僅能在BNIP3/Nix介導(dǎo)的線粒體自噬通路中發(fā)揮作用，還可與PINK1相互作用，在線粒體自噬中發(fā)揮作用[70]。因此，腦缺血再灌注損傷中Beclin1水平的上調(diào)或許可以激活線粒體自噬。

3 小 結(jié)

腦卒中的發(fā)病率、病死率逐年升高，以及對(duì)社會(huì)和患者家庭的壓力，使其防治進(jìn)一步得到重視。線粒體自噬通過選擇性清除線粒體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及應(yīng)激環(huán)境中細(xì)胞的存活均具有重要意義。很多研究顯示，可以靶向線粒體自噬來克服多種疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病、心力衰竭等[71-73]。但線粒體自噬的特殊選擇性，使其應(yīng)用于臨床變得異常困難。未來，應(yīng)深入研究線粒體自噬以助于更好地解析腦缺血再灌注病理過程，從而為靶向治療缺血性腦卒中提供新思路。