環(huán)狀RNA的研究進展及其在胃癌中的臨床意義

吳假假綜述，許利劍審校

0 引 言

胃癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位列第四，在世界癌癥死亡人數(shù)中排名第三［1］。盡管近來手術技術的改善及聯(lián)合化療的治療策略［2］，然而腫瘤分子多樣性造成的高臨床異質性，甚至具有相似的臨床特點及病理特征［3］，胃癌5年總體生存率依然很低；由此看出，早期診斷、早期治療，尋找有效的生物標志物就至關重要，近年關于circRNA在胃癌中的異常表達涌現(xiàn)一些研究，可能會對胃癌診斷及治療有意義，本文就此進行綜述，為胃癌患者的早期診斷、臨床治療及預后判斷提供新的理論依據(jù)。

1 circRNA的概述

1.1 概念環(huán)狀RNA（circRNA）是一類閉合的環(huán)狀結構，無3′端polyA結構及5′端帽狀結構，長度在幾百到幾千不等，不受RNA外切酶降解，穩(wěn)定且廣泛地存在于生物界，具有進化保守性［4］。circRNA在20世紀70年代即被發(fā)現(xiàn)，1979年，Hsu和Coca-Pra?dos報道利用電子顯微鏡在真核生物細胞質中發(fā)現(xiàn)了circRNA［5］，同時也開啟了該類RNA 的研究歷程。

1.2 circRNA的初步認識由于科學技術水平的限制，之前一直以為circRNA是基因錯誤轉錄及mRNA 加工的副產品［6］；在 2013 年，Jeck 等［7］在《RNA》發(fā)文提出circRNA發(fā)生的兩種模型：套索驅動環(huán)化；內含子配對驅動環(huán)化，表明circRNA不是簡單的錯誤剪接。另外研究表明circRNA可存在于細胞質、細胞核、血清外泌體以及唾液當中［8］。隨后人們陸續(xù)在酵母線粒體、丁型肝炎病毒中發(fā)現(xiàn)cir?cRNA，也發(fā)現(xiàn)在小鼠的睪丸內含有性別決定基因（sex-determining region Y，Sry）轉錄而來的circRNA，還證實了circRNA也存在于人體細胞［9］，由此看來，circRNA廣泛并穩(wěn)定的存在于真核生物中。

2 circRNA形成及功能

2.1 circRNA形成circRNA根據(jù)來源分為：外顯子序列形成的circRNA（ecircRNA）［7］、內含子序列形成的circRNA（ciRNA）［10］、內含子和外顯子共同形成的circRNA（EIciRNA）［11］。在形成circRNA期間，特異性序列是保守的，并且來自上游和下游區(qū)域的序列沿相反方向連接在一起，所有這些都通過反向剪接有助于成熟的circRNA［12］。雖然反向剪接的效率遠低于線性RNA，但由于其穩(wěn)定性和相對較長的半衰期，仍然存在大量的circRNAs。反向剪接機制取決于互補內含子匹配［13］，它在circRNA形成過程發(fā)揮重要作用。在該機制中，環(huán)形RNA的兩側具有特殊的重復序列，如Alu和其他短序列［14］。CircRNA前體的成環(huán)區(qū)域兩側的外顯子序列因重復序列（如Alu）發(fā)生互補配對成環(huán)，此后，在U6和U2的作用下，拼接體與成環(huán)的RNA前體結合，在蛋白復合物和U5核心的協(xié)同作用下，選擇性地剪切循環(huán)區(qū)域中的外顯子，同時，外顯子連接區(qū)序列也被反向切割，形成成熟的circRNA［15］。內含子circRNA形成的機制與外顯子circRNA的機制不同。內含子circRNA的形成依賴于5′剪切位點附近的富含GU的序列和靠近分支點的核苷酸C富集序列。兩個片段首先結合成環(huán)狀，然后通過拼接體剪切結合部分中的外顯子序列和內含子序列，其余內含子最終被拼接在一起形成成熟的 circRNA［9］。最近，Li等［11］發(fā)現(xiàn)另外一種新型的circRNA由外顯子和內含子組成，根據(jù)其互補序列過表達，然而精確的拼接機制尚未確定。

2.2 circRNA功能研究發(fā)現(xiàn)circRNA可能通過以下幾種方式發(fā)揮其生物學功能：

2.2.1 競爭的內源性RNA或miRNA海綿 研究已經證明，circRNACDR1as或 ciRS-7［4，16］，circ-SRY［16］，circ-ITCH［17］，circ-HIPK3［14］能夠起到miRNA海綿的作用。例如，首次觀察到一個充當miRNA海綿的circRNA是CDR1as，其具有70多個保守的miRNA-7的結合位點［18］。此外，circ-SRY是一種在小鼠睪丸中特異性表達的circRNA，與miRNA-138具有16個結合位點［16，19］。

2.2.2 與RNA結合蛋白相互作用 除了miRNA海綿的功能外，circRNA還可以與RNA結合蛋白相互作用，如 circFoxo3 和 circ-MBL（muscleblind）［20-21］。CircFoxo3能夠與許多類型的蛋白質結合，它可以通過與CDK2和p21相互作用來抑制細胞周期并阻止從G1到S期的轉變［21］。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)，內含子序列形成的circRNA可以在細胞質中積累，并與蛋白TDP43結合，抑制ALS（肌萎縮性側索硬化）中的TDP43毒性［22］。

2.2.3 調節(jié)mRNA穩(wěn)定性 一些circRNA可以調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。例如，來自CDR1as的環(huán)狀反義RNA可以與mRNA形成雙鏈體結構，使其穩(wěn)定［23］。此外，在小鼠巨噬細胞中，circ-RasGEF1B可以增強ICAM-1mRNA的穩(wěn)定性［24］。

2.2.4 調節(jié)基因轉錄 circRNA也可以調控基因轉錄。例如，兩種外顯子-內含子環(huán)狀RNA如circ-EIF3J和circ-PAIP2都可以與U1 snRNP結合以進一步與RNA Pol II相互作用并增強親本基因在HeLa和HEK293細胞中的表達［11］，因此外顯子和內含子共同組成的circRNA（EIciRNAs）可以在正反饋調節(jié)中發(fā)揮重要作用。CiRNA也可以調節(jié)基因轉錄。研究人員發(fā)現(xiàn)，ci-ankrd52和ci-sirt7也可以通過與Pol II相互作用可以作為其親本基因轉錄的正調控因子［10］。這表明內含子circRNA也可以調節(jié)親代基因轉錄。

2.2.5 翻譯蛋白質 內源性circRNA被證明能夠被翻譯成蛋白質。 Legnini等［25］發(fā)現(xiàn)在 IRES（內部核糖體進入位點）驅動下，circ-ZNF609可以翻譯小鼠成肌細胞中的蛋白質。在這個令人信服的證據(jù)出來之前，大多數(shù)研究人員認為circRNA是一類獨特的內源性非編碼RNA。然而發(fā)現(xiàn)能夠翻譯蛋白質的第一個circRNA是甲型肝炎病毒的基因組，該類病毒是一種單鏈環(huán)狀RNA，其可以產生122個氨基酸的蛋白質［26］。一些報告顯示，在起始密碼子上游具有IRES序列的人工環(huán)狀RNA可以在體外翻譯功能性GFP（綠色熒光蛋白）［27］。其他研究表明，具有多個FLAG編碼序列的合成環(huán)狀RNA也可以在不存在用于內部核糖體進入的任何特定元件的情況下通過類似于滾環(huán)擴增的機制翻譯蛋白質［28］。該發(fā)現(xiàn)使得circRNA具有新的功能，為今后的circRNA研究提供了新的方向。

3 circRNA在胃癌中的異常表達

Li 等［29］報 到 一 種 典 型 的 circRNA：cir?cRNA002059，在胃癌組織中，circRNA002059的水平比鄰近的正常組織顯著下調，還揭示了circRNA的低水平與遠處轉移之間的相關性，表明circRNA在胃癌組織中異常表達，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

3.1 胃癌中上調的circRNA

3.1.1 CircPVT1 Chen等［30］通過qRT-PCR檢測胃癌組織和相鄰正常組織中circPVT1的表達，結果表明，胃癌組織中的circPVT1表達明顯高于對照組相鄰正常組織。CircPVT1通過作為海綿抗miR-125家族成員促進胃癌細胞增殖，除了促進胃癌生長，功能研究進一步證實了circPVT1在胃癌中高度表達是胃癌患者生存的獨立預后指標.

3.1.2 circRNA0047905、0138960、769015 Lai等［31］通 過 分 析 RT-PCR 實 驗 數(shù) 據(jù) ，證 實 了 cir?cRNA0047905，circRNA0138960和circRNA7690-15在胃癌組織中顯著上調，其機制可能為調節(jié)親本基因如SERPINBmRNA、GDAmRNA的表達。他們通過繪制一個接收機工作特性曲線進一步評估了這3種環(huán)狀RNA的診斷價值。我們發(fā)現(xiàn)cir?cRNA0047905曲線下面積（AUC）為 0.85（95%CI：0.751-0.950），表明circRNA0047905的診斷準確度最高。circRNA0138960和circRNA7690-15具有較低的診斷準確性，circRNA0138960和circRNA7690-15的 AUC 分別為 0.647（95%CI：0.508-0.786）和0.681（95%CI：0.546-0.815）。

3.2 胃癌中下調的circRNA

3.2.1 circRNA0000745 其由精子抗原與calponin同源性和卷曲螺旋結構域1基因編碼形成，位于chr17：20107654-20109225。Huang 等［32］研究發(fā)現(xiàn)circRNA0000745在胃癌組織中表達下調，下調機制可能與其可綁定一系列miRNA相關，其表達水平與腫瘤類型有關，circRNA0000745的ROC曲線下面積（AUC）在血漿中為0.683，若結合癌胚抗原，AUC增加至0.775，表明具有良好的診斷價值，但仍未發(fā)現(xiàn)與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期有統(tǒng)計學價值，具體與腫瘤的病理學特點仍需進一步探索。

3.2.2 circRNA100269 CircRNA100269是染色體1的GRCh38.p7的外顯子circRNA轉錄物，Zhang等［33］發(fā)現(xiàn)CircRNA100269在胃癌中下調，通過靶向miR-630抑制腫瘤細胞生長，兩者在胃癌組織中呈負相關，表明circRNA極有可能成為胃癌早期診斷和預后的穩(wěn)定的腫瘤標志物。

3.2.3 circRNA LARP4 Zhang等［34］發(fā)現(xiàn) circRNA LARP4在胃癌中抑制細胞增殖與侵襲，機制是通過海綿狀miR-424-5p和調節(jié)LATS1表達，高miR-424-5p的表達或LATS1低表達與胃癌患者的病理分期，總體生存率呈正相關，miR-424通過靶向LATS1基因促進細胞的生長與侵襲，證明circLARP4起到腫瘤抑制作用，進一步確定了致癌miR-424與LATS1表達呈負相關。這可能在腫瘤診斷、預后和治療上作為新穎的生物標志物。

3.2.4 circRNA0001649 Li等［35］研究 表 明 ，cir?cRNA0001649在胃癌組織及血清中均下調（P值＜0.01），可能與胃癌類型有關，具有相對較高的敏感性及特異性，可能作為篩查胃癌的生物標志物，但具體的分子機制仍需進一步探索。

3.2.5 circRNA104916 通過數(shù)據(jù)庫CircBase發(fā)現(xiàn)circ-104916是從染色體區(qū)域9q33.3生成的，該區(qū)域由NEK6的外顯子1、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6和外顯子8反向剪接。成熟circ-104916轉錄物是651nt的環(huán)狀RNA分子［36］。Li等［37］通過微陣列分析研究發(fā)現(xiàn)circRNA104916通過抑制上皮間質轉化從而抑制腫瘤細胞，分子表達水平與腫瘤入侵深度、分期、淋巴轉移及神經侵襲有關，另外miR-7間接靶向 FAK 上調 E-鈣粘蛋白和 IGF1R［38-39］，從而降低上皮至間質轉變，減少不依賴貼壁的生長和轉移的抑制，總結以上，circRNA104916可能通過靶向miR-7發(fā)揮作用，可見，CircRNA可成為一個新的治療靶點和潛在的胃癌生物標記。

3.3 circRNA與胃癌術后復發(fā)已經有報道稱cir?cPVT1，circ0000190 和 4 個 基 于 circRNA（ cir?cRNA101308、circRNA104423、circRNA104916和circRNA100269）的分類器是胃癌患者生存和復發(fā)的獨立預后標志物［30，40］。胃癌復發(fā)的風險評分公式是以個人為基礎建立的（1.434×circRNA101308的狀態(tài)）-（0.917×circRNA104423的狀態(tài)）-（1.042×cir?cRNA104916的狀態(tài)）-（1.201×circRNA100269的狀態(tài)），其中高表達狀態(tài)等于1而低表達狀態(tài)等于0。臨界值是由X-tile軟件計算的“-1”。當危險評分高于臨界值時，將患者納入高危組。否則，患者被納入低風險組。使用這個分類器，我們可以從高風險的胃癌患者中區(qū)分早期復發(fā)風險低的患者。

3.4 作為胃癌生物標志物生物標志物被定義為可以在血液，體液或組織中發(fā)現(xiàn)的生物實體，其可以是正?；虍惓＿^程或病癥或疾病的征兆。生物標志物的使用已經成為早期檢測和診斷不同疾病以及衡量對某些治療方法的反應的手段。以下幾個特征使其適合臨床使用，①穩(wěn)定的結構：大多數(shù)circRNA顯示出半衰期48 h，mRNA的平均半衰期為10 h［41］。不像線性 RNA，3′和 5′末端不暴露在 cir?cRNA中；因此，它們對核糖核酸酶（如核酸外切酶或核糖核酸酶R）不敏感，并且具有較長的半衰期；②組織特異性：根據(jù)動物實驗，來自Rmst和Klhl2的環(huán)狀RNA在小鼠腦中高度表達，但不在肝臟或肺中表達［42］。由于其獨特的結構，circRNA在組織、血清、尿液中更穩(wěn)定，從數(shù)千個circRNA篩選敏感和特異性分子生物的可能性也更大。通過RT-PCR和原位雜交測試circRNA也比通過抗原-抗體反應檢測蛋白質更靈敏，與相鄰非腫瘤組織相比，circRNA在胃癌組織中上調或下調，通過將其與各種其他生物標志物組合，從而提高診斷的準確性和特異性。

3.5 可能作為胃癌靶向治療目標腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM分期及遠處轉移是影響腫瘤患者結局的重要因素，而circRNA與胃癌上述臨床病理因素相關，大膽預測各種CircRNA可作為胃癌治療的靶點，要么減少功能轉錄物的循環(huán)，要么使用“mRNA陷阱”來阻斷轉錄本中功能失調的外顯子［18，41］。在細胞中循環(huán)miRNA海綿是基于RNA的癌癥治療新的候選者。研究人員最近報道，一種環(huán)狀的人造miRNA海綿可能會誘導癌細胞中的miRNA功能喪失［43］。Liu等［43］構建了包含來自T4噬菌體基因td的第I組內含子的置換的內含子-外顯子序列并產生針對miR-21和miR-221的環(huán)狀miRNA海綿的環(huán)狀miRNA海綿表達載體。作為表達線性海綿的替代載體，本研究中描述的RNA的表達載體開辟了新的方式來提供具有持久效應的miRNA海綿，并且具有巨大的癌癥研究和治療潛力。ciRS-7作為強有力的環(huán)狀miR-7海綿起作用，其含有多個結合miR-7的miRNA反應元件［44］。因此，它可以瞬間結合或釋放大量的miR-7分子，從而有效調節(jié)疾病網絡［45］。由此可以看出，雖然靶向circRNA與人類疾病尚處于起步階段，但隨著對circRNA研究的深入，肯定會為胃癌的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

4 結語與展望

CircRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的新型分子。它們不再被認為是轉錄錯誤的產物。相反，由于其重要的功能，它們已成為miRNA和lncRNA后最受歡迎的研究課題［46］，它們可能在基因表達和信號通路中發(fā)揮重要作用，并參與一些疾病的發(fā)展。如上所述，circRNA已顯示出巨大的疾病診斷與治療的潛力［47］。目前，臨床中使用的分子生物標志物總是具有低器官特異性。例如，CEA在消化道腫瘤中很常見，而CA19-9在各種腺癌中很常見。如果將cir?cRNA作為胃癌的生物標志物用于臨床，它們的特異性表達可能有助于解決現(xiàn)有標志物的低器官特異性問題。然而，circRNA在診斷上也具有一些缺點。首先，檢測組織或外泌體中的circRNA比現(xiàn)有檢測更昂貴，這限制了circRNA作為生物標志物的廣泛使用；第二，使用circRNA進行診斷的可靠性仍然需要被證明。現(xiàn)在盡管對circRNA的產生及其確定的功能有了初步的了解，但仍需要大量的研究，相信在不久的將來circRNA會在胃癌預防、診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用。