羊水細胞原位培養(yǎng)及核型制備方法的改進

鄭 靜，卓 越，劉艷妮

0 引 言

自1966年Steele等［1］首次報道將羊水染色體核型分析應(yīng)用于胎兒染色體疾病的產(chǎn)前診斷以來，其仍是產(chǎn)前診斷染色體疾病的金標準。但由于羊水培養(yǎng)的影響因素較多成功率較低，國內(nèi)的各大實驗室都根據(jù)自己的現(xiàn)有條件建立了一套適合自己的培養(yǎng)方法。地理氣候條件對其成功率影響較大，因此建立一套全國通用的培養(yǎng)方法和條件非常有必要。本室自2012年開始摸索羊水采集、培養(yǎng)、收獲、制片步驟的條件，至今形成了一套羊水染色體核型制作的流程，現(xiàn)將其報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2012年1月至2017年12月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的孕15～22+6周單活胎妊娠孕婦435例，孕婦年齡21～34歲，平均（26.45±3.62）歲。孕婦均有羊膜腔穿刺的指征，包括：單純高齡（年齡≥35歲）；血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險（21-三體≥1/270、18-三體≥1/350）；無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測（21、18、13號染色體）陽性結(jié)果的孕婦；不良妊娠史（反復(fù)胚停、多次自然流產(chǎn)、生育過畸形兒、智障兒以及唐氏兒）；超聲發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)育異常；近親結(jié)婚；夫婦患病、染色體異常；不良接觸史等。排除標準：先兆流產(chǎn)患者；體溫高于37.4℃；有出血傾向（血小板≤70×109/L，凝血功能檢查異常）；有盆腔或?qū)m腔感染征象。本研究由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批準號為：倫研批第2018-026-01號），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 羊水標本采集 常規(guī)羊水抽取方法采集羊水標本。注意采集前醫(yī)生雙手搖晃孕婦腹部，便于胎兒脫落的細胞懸浮。在B超介導(dǎo)下用9號腰椎穿刺針經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺，棄去最初抽取的1～2 mL羊水，另換注射器抽取羊水20～30 mL。羊水中如有明顯血性羊水，立即在羊水中加入0.5 mL無菌肝素。

1.2.2 羊水細胞培養(yǎng) 每份羊水對應(yīng)接種2個培養(yǎng)瓶和1個培養(yǎng)皿。將羊水平均加入4支10 mL離心管內(nèi)，950 r/min離心10 min，棄上清留1 mL細胞層。羊水離心后根據(jù)沉淀物顏色和體積分為5～10 mm3白色細胞團塊，5～10 mm3棕色團塊，10～15 mm3棕色團塊，5～10 mm3鮮紅色團塊，10～15 mm3鮮紅色團塊組，吸管打勻沉淀后合并至1支離心管中，F(xiàn)ancon 25 mL一次性帶濾膜的培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)加入2.5 mL GIBCO Amnio-Max培養(yǎng)液，再加入1.5 mL上述細胞懸液。將載玻片放入Φ3cm的Fancon培養(yǎng)皿內(nèi)，預(yù)加入2.5 mL培養(yǎng)液，再加入剩余的1 mL細胞懸液。5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃半開放式培養(yǎng)。接種6 d后開始觀察，7 d換液。一般8 d收獲，但應(yīng)根據(jù)細胞生長狀況適當調(diào)整收獲時間。于終止前4 h加入秋水仙素，終濃度為20μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

選取沒有任何出血、狀態(tài)良好的羊水共90份，根據(jù)采集羊水過程中使用材質(zhì)分為塑料組、塑料聯(lián)合玻璃組、玻璃組，各30份。

1.2.3 羊水細胞收獲 培養(yǎng)瓶制片：當每個羊水細胞克隆內(nèi)細胞分布較均勻細胞不密集時，采用原位法制片。0.075 mol/L KCL 6 mL 37℃低滲35 min再加入固定液2 mL（甲醇：冰醋酸=3：1）混勻，預(yù)固定5 min后棄去50%再加入固定液2 mL混勻，5～10 min后全部倒掉再加入6 mL固定液-20℃冰箱過夜。第2天去除上蓋，室溫28℃濕度50%的環(huán)境中，沸水蒸汽上熏蒸30～40 s分散，緩慢干燥瓶壁。50℃烤片2.5 h，胰酶法G顯帶。培養(yǎng)皿制片：低滲固定步驟同上。第2天分散步驟同上，用中性樹膠黏于蓋玻片上。烤片顯帶同上。常規(guī)計數(shù)20個核型，分析4個分散良好、大于400條帶的染色體核型，嵌合體核型計數(shù)增至100個分裂相。

選取培養(yǎng)良好的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿共100例，根據(jù)制片時環(huán)境溫度和濕度分為4組，每組25例。①20℃室濕20%組；②28℃室濕20%組；③20℃濕度50%組；④28℃濕度50%組。每組在相應(yīng)的溫度、濕度環(huán)境下進行沸水蒸汽熏蒸分散核型步驟，顯微鏡下評定載玻片的得分?！?0分：可分析分裂相很多，每條染色體顯帶明顯、著色適中均勻。89～80分：可分析分裂相比較多，疊加的染色體通過軟件分開后都可辨認。79～70分：可分析分裂相適中，疊加的染色體通過軟件分開后都可辨認。69～60分：有可分析分裂相，疊加的染色體通過軟件分開后半數(shù)可辨認，其余得通過與另一有經(jīng)驗的診斷者討論后才可確定。＜60分：可分析分裂相不多，疊加的染色體通過軟件分開后半數(shù)可辨認。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，符合正態(tài)分布兩組間比較采用LSD-t檢驗，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。定性資料以頻數(shù)（%）形式表示，采用χ2檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 羊水培養(yǎng)結(jié)果435例標本培養(yǎng)成功406例，一次性培養(yǎng)成功率93.3%。

2.2 羊水離心后沉淀的顏色、多少的培養(yǎng)結(jié)局分析10～15 mm3棕色團塊組和10～15 mm3鮮紅色團塊組細胞培養(yǎng)的成功率（72.72%、56.25%）較白色團塊組培養(yǎng)的成功率（95.98%）均明顯降低（P＜0.01）；10～15 mm3鮮紅色團塊組細胞培養(yǎng)的成功率較5～10 mm3鮮紅色團塊組培養(yǎng)的成功率明顯降低（56.25%vs 90.48%，P＜0.01）。

2.3 不同材質(zhì)的培養(yǎng)結(jié)局分析塑料組和塑料聯(lián)合玻璃組細胞培養(yǎng)成功率（56.67%、70.00%）較玻璃組細胞培養(yǎng)成功率（93.33%）均明顯降低（P＜0.01）。

2.4 不同環(huán)境溫度和濕度的的核型分散程度得分20℃室濕20%組、28℃室濕20%組、20℃濕度50%組載玻片得分明顯低于28℃濕度50%組（P＜0.01）；20℃室濕20%組、28℃室濕20%組載玻片核形分散程度得分明顯低于20℃濕度50%組（P＜0.01），見表1。

表1 不同環(huán)境溫度和濕度的核型分散程度得分（n=25）Table 1 Correlation analysis between environmental tem?perature and humidity and the degree of karyo?type dispersion（n=25）

3 討 論

羊水細胞及絨毛細胞的染色體分析仍是唐氏綜合征確診的標準方法，由于羊水細胞大部分是衰老和固縮的脫落細胞，羊水細胞培養(yǎng)較其他組織培養(yǎng)更困難［2］。對嚴重鮮血性羊水來說，由于混入了大量的紅細胞，紅細胞凝集時不但把羊水細胞凝集起來嚴重影響成活羊水細胞的貼壁，還會占據(jù)培養(yǎng)瓶的表面導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。李從青等［3］研究發(fā)現(xiàn)羊水紅細胞計數(shù)在羊水細胞培養(yǎng)結(jié)局中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，10～15 m3鮮紅色團塊組（代表穿刺出血較多）培養(yǎng)的成功率明顯低于正常羊水，明顯低于5～10 m3鮮紅色團塊（代表穿刺中有少量出血），與李從青等研究不同。周君等［4］研究發(fā)現(xiàn)，將帶血的羊水離心后平均分置于4個培養(yǎng)瓶中，有效地降低血液的濃度，有利于羊水細胞貼壁。本實驗對于有明顯鮮血性的羊水，采取立即加入0.5 mL無菌肝素，然后離心并用培養(yǎng)液反復(fù)洗滌的方法，可以提高羊水培養(yǎng)的成功率；對于離心后少量殘存的紅細胞仍會占據(jù)培養(yǎng)瓶表面的問題，我們采用比正常羊水多加入2 mL培養(yǎng)液的方法稀釋紅細胞濃度，減少其對成活羊水細胞貼壁的影響。對于陳舊性出血的羊水來說，本研究發(fā)現(xiàn)可能是紅細胞早已經(jīng)破裂，最新脫落的胎兒細胞已經(jīng)不受紅細胞黏附的影響，所以成功率還是很高。本實驗正常的羊水仍有29例培養(yǎng)失敗，可能由于離心后沉淀的細胞太少導(dǎo)致。

接觸羊水的耗材包括一次性注射器、離心管、吸管等塑料材質(zhì)的耗材皆有細胞毒性。王文佳等［5］通過MTT檢測法定量檢測了一次性使用無菌注射器及活塞對小鼠成纖維細胞L-929的體外細胞毒性，結(jié)果表明注射器活塞存在4～5級細胞毒性，無菌注射器器身部分均存在3～4級細胞毒性，均呈重度細胞毒性。劉宇英等［6］研究一次性注射器所用的硅油潤滑劑對家兔肺組織造成的損傷表明硅油潤滑劑以散粒的形式經(jīng)靜脈進入機體，可對肺組織造成損傷。方天等［7］研究發(fā)現(xiàn)長時間尾靜脈注射高劑量介孔二氧化硅納米球溶液對小鼠肝和肺有一定程度的損傷。程玲等［8］研究發(fā)現(xiàn)，注射器滅菌的過程中，原材料聚丙烯和橡膠活塞吸附一定量的環(huán)氧乙烷，如果解析時間不夠的話，殘留的環(huán)氧乙烷就會產(chǎn)生較大的毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，使用一次性塑料注射器抽取羊水后，即使后續(xù)操作使用玻璃器具，其培養(yǎng)的成功率還是低于使用玻璃注射器抽取的羊水，究其原因為一次性注射器的細胞毒性所致。常規(guī)使用的吸管、離心管等大多為聚乙烯或聚氯乙烯等材質(zhì)，對細胞和蛋白質(zhì)類的物質(zhì)有很大的吸附性。塑料器具的使用會損失一部分羊水細胞，增加了羊水細胞培養(yǎng)的難度。本實驗將器具皆換成玻璃材質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的成功率明顯提高了。實驗所用玻璃器具皆用酸液浸泡后高壓滅菌，穿刺針用84消毒液浸泡后高壓滅菌。

培養(yǎng)成功后，制作完美的核型分析載玻片是能否做出最后診斷的關(guān)鍵步驟。大多數(shù)實驗人員在固定步驟完畢后，就直接在室溫中進行核型分散的操作，未考慮溫度濕度對核型分散程度的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在濕度50%的環(huán)境中要比直接在室濕中熏蒸的核型更加容易分散，室溫室濕與28℃室濕差異無統(tǒng)計學(xué)意義。可見濕度在后期制片方面起著決定性的作用，其原因可能與細胞受熱劇烈膨脹至破裂后，單條染色體在合適的溫度濕度條件下更加容易分散有關(guān)。

原位培養(yǎng)法還需要注重收獲時間，如時間過早或過晚在原位片上就得不到滿意的分裂相。細胞和克隆形態(tài)分為3類：F克隆、AF細胞克隆及E類克隆。如果上皮細胞和類纖維細胞生長過度可以適當增加KCL的用量和低滲的時間，有助于克服不宜分散的難題。培養(yǎng)至第6～8天觀察時發(fā)現(xiàn)羊水細胞克隆內(nèi)細胞分布較密集時，我們一般不采用直接原位法制片，而是采用細胞刮方法傳代，培養(yǎng)瓶中加入3.5mL新鮮培養(yǎng)液刮下數(shù)個“魚眼樣”的細胞克隆，用吸管在瓶內(nèi)吹打30～40下，讓細胞重新貼壁生長，培養(yǎng)1～3d后再原位法制片，這樣制作的核型片子更易于觀察。

綜上所述，通過對影響羊水細胞培養(yǎng)及核型分散的因素分析證明，及時、正確的處理帶血的羊水標本，全部采用玻璃材質(zhì)的器具，控制好分散過程中環(huán)境的溫濕度（最佳28℃、50%），抓住羊水細胞收獲時機，可以提高羊水細胞培養(yǎng)的成功率。