還原性谷胱甘肽對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外冷藏保存活性保護(hù)作用研究*

胡堅(jiān)方，汪照函，雷雪揚(yáng)，鄧長(zhǎng)青，劉文婧，羅 文

(江西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類可自我更新且具有多向分化潛能的細(xì)胞。其在一定的培養(yǎng)條件下能分化為肝、肌腱、肌肉、成骨、軟骨、脂肪細(xì)胞[1-2]。實(shí)驗(yàn)室目前常用于分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法包括全骨髓貼壁法/貼壁篩選法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法和細(xì)胞篩選法，其中全骨髓貼壁法和密度梯度離心法較為常用[3-4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中的成分極少，約占骨髓單個(gè)核細(xì)胞的0.001%～0.010%[5-6]。隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床治療中尤其是血液科的應(yīng)用不斷增多，其治療方法成為部分醫(yī)院常用的治療措施。要利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，則必須體外進(jìn)行分離及培養(yǎng)擴(kuò)增。在準(zhǔn)備進(jìn)一步的操作時(shí)，需對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞冷藏運(yùn)輸以及處理，其增殖、生長(zhǎng)特性有無(wú)影響及保護(hù)措施目前尚無(wú)人研究。實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞從骨髓中分離出來(lái)，體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，觀察其增殖效果、生長(zhǎng)特性等。實(shí)驗(yàn)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離過(guò)程中的冷藏條件進(jìn)行探討，以期獲得生長(zhǎng)狀態(tài)好且數(shù)量足夠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 日本健康成年雄性大耳白兔12只，單只質(zhì)量約2 500克，由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(京)2008-0014，實(shí)驗(yàn)前自由喂食及喂水，嚴(yán)密觀察。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合江西省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2 試劑和儀器 冷藏冰箱購(gòu)自青島海爾，CD19，CD34，CD44，CD45和CD90購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；CD29免疫磁珠，LD柱和磁性細(xì)胞分離器購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；IX53型熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯。

1.3 方法

1.3.1 兔骨髓的抽?。旱饩埔掖冀荽蠖淄秒p耳，于耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉按1 ml/kg予以麻醉。予仰臥位固定兔頭部及四肢于兔臺(tái)上，髂前上棘穿刺骨髓，抽取5 ml骨髓液。骨髓液于5 g/L肝素抗凝。

1.3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：將抽取的骨髓加入等量PBS溶液混勻，室溫1 000 r/min離心6 min，棄上層脂肪組織及上清液，加入等量Percoll分離液(密度為1.073 g/ml)[7]，4℃ 2 500 r/min離心20 min。離心后細(xì)胞分層，呈云霧狀白膜層的細(xì)胞層即為實(shí)驗(yàn)需要的單個(gè)核細(xì)胞層，輕輕吸取單個(gè)核細(xì)胞層的細(xì)胞。分離的單個(gè)核細(xì)胞置于新的離心管中，加入PBS再次離心5 min，吸棄上清液。然后加入α-MEM培養(yǎng)液(含10 ml/dl胎牛血清，青霉素及鏈霉素)懸浮，充分混勻，放置于37℃， 5 ml/dl CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后換液，以后每三四天換液1次，待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁形成克隆島后進(jìn)行消化，進(jìn)行免疫磁珠篩選及純化。

1.3.3 免疫磁珠系統(tǒng)分選單個(gè)核細(xì)胞：將首次原代培養(yǎng)后的細(xì)胞用胰酶消化，PBS離心洗滌并加入100 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μl CD29的免疫磁珠，4℃孵育30 min后將細(xì)胞懸液加入分離柱中，細(xì)胞過(guò)柱后將結(jié)合在分離柱中，洗脫分離柱中CD29陽(yáng)性細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行純度測(cè)定[8]。

1.3.4 單個(gè)核細(xì)胞免疫表型鑒定：將免疫磁珠系統(tǒng)分離的細(xì)胞用PBS離心洗滌，制備成2×105/管細(xì)胞懸液，分別加入單克隆抗人抗體CD19，CD34，CD44，CD45和CD90，避光條件下孵育30 min，加入1 ml PBS后以1 500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次；將細(xì)胞重懸于500 μl PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)記明確有無(wú)干細(xì)胞特質(zhì)[9-10]。

1.3.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制：將分選后的符合干細(xì)胞特質(zhì)的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將第3代傳代培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/L，接種于24孔板中，每板分6組，每組4孔，1 ml/孔，在體外4℃冷藏，根據(jù)冷藏的時(shí)間和條件，將分離的單個(gè)核細(xì)胞分為6組，即0 h組(對(duì)照組)，6 h組，12 h組，24 h組。并將12 h組進(jìn)行還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)(分子量307.32 g/mol)干預(yù)，將12h組與還原性谷胱甘肽共同培養(yǎng)，設(shè)為12 h+0.5 mmol/L GSH組，12 h+1.0 mmol/L GSH組。將冷藏后的細(xì)胞于37℃，5 ml/dl的CO2飽和濕度培養(yǎng)。0.25 g/dl胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，求出平均值，每天計(jì)數(shù)，連續(xù)8天。以時(shí)間(天)為橫軸，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞平均值(Cell count，1×106)為縱軸，采用EXCEL散點(diǎn)圖型繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)觀察 正常對(duì)照(0 h)組：分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)10～12 天后大部分細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，少部分呈多角形；12 天左右可鋪滿瓶底。

2.2 免疫磁珠分選單個(gè)核細(xì)胞 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，對(duì)照組CD29陽(yáng)性細(xì)胞比例為0.37%(圖1A和圖1B)。而經(jīng)免疫磁珠分選后，洗脫的CD29陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到91.72%(圖1C和圖1D)，同型免疫磁珠分選的CD29陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到較高的純度。

圖1 免疫磁珠分選后兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD29陽(yáng)性細(xì)胞比例

2.3 單個(gè)核細(xì)胞免疫表型鑒定 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，免疫磁珠分選后的單個(gè)核細(xì)胞表面標(biāo)志物的陽(yáng)性比例為CD44 98.1%(圖2A)，CD90 97.6%(圖2B)，不表達(dá) CD19 3.67%(圖2C)，CD45 4.76%(圖2D)，CD34 1.19%(圖2E)。其獲得傳代細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常用標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)

2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 見圖3。12 h組和24 h組細(xì)胞的增殖能力明顯低下。在以下4組中，6 h組與對(duì)照組生長(zhǎng)曲線相近，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.200，P>0.05)。12 h組，24 h組與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性弱于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.812，P=0.000 1；t=55.541，P=0.000 0)。24 h組細(xì)胞活性弱于12 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.65，P=0.000 5)。6 h組，12 h+0.5 mmol/L GSH組，12 h+1.0 mmol/L GSH組與對(duì)照組的細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

3 討論

干細(xì)胞可治療的疾病種類較多，涉及到各個(gè)系統(tǒng)疾病，包括肺間質(zhì)性疾病、冠心病、神經(jīng)損傷、骨髓移植、肝炎后肝硬化等[11-13]。干細(xì)胞的來(lái)源、提取、保存等關(guān)鍵問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)中Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法是根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞比重配制密度為1.073 g/L的分離液，操作快捷，對(duì)細(xì)胞活性影響小，分離后獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度高。對(duì)免疫磁珠分離出的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行免疫分型測(cè)定，其具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特質(zhì)，和國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相同[9-10，14]。

生物樣本在越低溫度下保存其代謝越緩慢，而在冷藏或者冰凍狀況下其溶液結(jié)晶可能會(huì)刺破細(xì)胞膜[15]，0～4℃的冷藏條件為目前常用運(yùn)輸或者術(shù)前準(zhǔn)備所保持的溫度，為此實(shí)驗(yàn)選擇4℃為冷藏保存溫度，本實(shí)驗(yàn)首次探索冷藏保存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞其時(shí)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞活性可能的影響。實(shí)驗(yàn)中分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，將單個(gè)核細(xì)胞分別冷藏0 h，6 h，12 h和24 h后發(fā)現(xiàn)，冷藏對(duì)分離的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)活性有著不同程度的下降，表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度的減緩，以及增殖能力的下降。從生長(zhǎng)曲線來(lái)說(shuō)，冷藏12 h和24 h對(duì)單個(gè)核細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響大于6 h。而冷藏24 h組的細(xì)胞生長(zhǎng)活性弱于12 h組，提示冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性抑制效果越顯著。以上結(jié)果提示6 h的冷藏保存對(duì)肝細(xì)胞的活性損傷較小，而更長(zhǎng)時(shí)間的體外冷藏對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖有著一定的抑制作用，建議臨床運(yùn)輸或者術(shù)前準(zhǔn)備干細(xì)胞，其冷藏保存時(shí)間不應(yīng)超過(guò)6 h，超過(guò)12 h將對(duì)干細(xì)胞的活性有著較為顯著的破壞。

目前認(rèn)為，還原性谷胱甘肽對(duì)于體外細(xì)胞的培養(yǎng)起著保護(hù)的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)首次將還原性谷胱甘肽共培養(yǎng)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，已明確其對(duì)干細(xì)胞的冷藏保存有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)顯示單個(gè)核細(xì)胞冷藏12h前分別加入0.5 mmol/L和1.0 mmol/L還原性谷胱甘肽，其對(duì)單個(gè)核細(xì)胞生長(zhǎng)的活性有較大提高或保護(hù)，生長(zhǎng)曲線顯示略低于6 h組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異。提示還原性谷胱甘肽對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞冷藏活性的抑制效果起著保護(hù)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示干細(xì)胞的臨床應(yīng)用前的0～4℃保存時(shí)間不應(yīng)超出6 h，而加入0.5 mmol/L或1.0 mmol/L還原性谷胱甘肽對(duì)干細(xì)胞的冷藏保存有一定的保護(hù)活性作用。推測(cè)還原性谷胱甘肽抗氧化以及提供代謝能量作用的特點(diǎn)可能起著一定的作用。

Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法對(duì)于兔骨髓的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞起著良好的分離效果。體外冷藏對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)活性有著一定的抑制效果，還原性谷胱甘肽對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞冷藏保存起著保護(hù)活性的作用，其作用機(jī)制需作進(jìn)一步的研究探討。